Ο ιός Epstein-Barr (EBV) και η μεμβρανική πρωτεΐνη 1 της λανθάνουσας φάσης (LMP-1) στη χρόνια λεμφογενή λευχαιμία και τα λεμφώματα χαμηλής κακοήθειας

Abstract

Epstein-Barr virus (EBV) is a universally present herpesvirus that can cause a latent infection of the memory Β cells. During latency, it expresses only a small part of its genome, comprising of six nuclear antigens (EBNAs), two EBV encoded RNAs (EBER1/2) and two latent membrane proteins (LMP1/2).LMP1 is a strong imitator of CD40 and is implicated in the malignant transformation of EBV infected cells, through antiapoptotic signals and NF-kB activation. Recently, it has been shown that its role may be more complex, with antiapoptotic as well as apoptotic properties.Our aim was to investigate the role of EBV and LMP1 in non-EBV related entities, such as chronic lymphocytic leukemia (CLL) and low grade B-cell lymphoma,Patients with CLL and low grade B-cell lymphoma with immunophenotypically confirmed disease by blood were enrolled. DNA, RNA and protein extraction were carried out before and after 3 cycles of rituximab-based immunochemotherapy. The EBV viral load was quantified by real time PCR, LMP1-mRNA was detected by RT-PCR and LMP1-protein by ELISA. FcgRIIA polymorphisms were detected by allele specific restriction enzyme digestion (ASRED). Survivin-mRNA was quantified by real time RT-PCR.Sixty five patients were enrolled. The results are as follows.A.Correlation of FcgRIIA polymorphisms with EBV and LMP1. We detected FcgRIIApolymorphisms in the blood samples of 40 patients and showed that the R131 polymorphic locus waspresent in 84.2% of EBV+, but only in 28.5% of EBV- patients (p=0.001). The correlation with LMP1expression was quite similar (84.5% vs 28.5%, p=0.002) and shows that FcgRIIA polymorphismsconstitute a genetic risk factor for EBV latency and LMP1 expression.B.Correlation of survivin levels with EBV and LMP1. Survivin is a member of the inhibitors ofapoptosis (LAP) family, and is implicated in the pathogenesis of neoplasia. Survivin-mRNA levels weremeasured in 64 patients and found 8.37 times higher in EBV- patients (p=0.002) and 6.36 times higherin LMP1- patients (p=0.008), a result implying a preponderance of LMP1 apoptotic effects in thispatient group.C.Investigation of the effect of rituximab on the EBV load of 44 patients that were treated withrituximab based immunochemotherapy. Among 17 EBV+ patients, only one had a persistentlymeasurable viral load following treatment. Moreover, this was the only patient with disease progressiondespite treatment. Rituximab is able to eradicate EBV from the blood, although it is responsible forreactivation of other viral infections. This fact may have several interesting implications that remain tobe studied.

Ο ιός Epstein-Barr (EBV) είναι ερπητοϊός παγκόσμιας κατανομής που έχει την δυνατότητα να προκαλεί λανθάνουσα λοίμωξη στα Β κύτταρα μνήμης, κατά την οποία εκφράζεται μικρό μέρος του γονιδιώματός του - έξι πυρηνικά αντιγόνα του ιού (EBNAs), δύο κωδικοποιούμενα από τον ιό RNA (EBER-1/2) και δύο μεμβρανικές πρωτεΐνες (LMP-1/2).Η LMP-1 αποτελεί ισχυρό μιμητή του CD40 και ενοχοποιείται για την κακοήθη μετατροπή των προσβεβλημένων από τον ιό κυττάρων, καθώς ευθύνεται για την συνεχή αποστολή σημάτων αναστολής της απόπτωσης και την ενεργοποίηση της οδού του NF-κΒ. Τελευταία πιθανολογείται ότι ο ρόλος της LMP-1 είναι διπλός, με δράσεις αντιαποπτωτικές αλλά και αποπτωτικές.Στόχος της διατριβής είναι η μελέτη του EBV και της LMP-1 στη χρόνια λεμφογενή λευχαιμία και τα λεμφώματα χαμηλής κακοήθειας, που αποτελούν νοσήματα μη σχετιζόμενα αιτιοπαθογενετικά με τον ιό.Στην μελέτη συμπεριλήφθηκαν ασθενείς με ΧΛΛ και λεμφώματα χαμηλής κακοήθειας με ανοσοφαινοτυπικά επιβεβαιωμένη νόσο στο αίμα. Έγινε απομόνωση DNA, RNA, πρωτεΐνης και ορού από δείγματα αίματος πριν και μετά από 3 κύκλους ανοσοχημειοθεραπείας με βάση τη ριτουξιμάμπη. Το ιικό φορτίο του ιού ποσοτι κόποι ήθη κε με real time PCR. Με απλή RT-PCR έγινε η ανίχνευση του mRNA της LMP-1 και με ELISA της πρωτεΐνης LMP-1 στον ορό. Η ανίχνευση του πολυμορφισμού του FcyRIIA έγινε χρησιμοποιώντας μέθοδο πέψης με ειδικό περιοριστικό ένζυμο (ASRED). Τέλος, έγινε ποσοτικοποίηση του mRNA της survivin με real time RT-PCR.Στη μελέτη συμπεριλήφθηκαν 65 ασθενείς. Τα επιμέρους αποτελέσματα έχουν ως εξής.Α. Συσχέτιση των πολυμορφισμών του FCYRIIA με τον ιό και την έκφραση της LMP-1. Έγινε ανίχνευση των πολυμορφισμών του FcyRIIA έγινε στους 40 πρώτους ασθενείς και έδειξε ότι η πολυμορφική θέση R131, που έχει χαμηλότερη συγγένεια για την IgG, ανιχνεύθηκε στο 84,2% των EBV+, αλλά μόνο στο 28,5% των EBV- ασθενών (ρ=0,001). Παρόμοια ήταν και η συσχέτιση με την έκφραση της LMP-1 (84,6% έναντι 28,5%, ρ=0,002). Η συσχέτιση αυτή αποτελεί ένδειξη ότι οι πολυμορφισμοί του FcyRIIA αποτελούν γενετικό παράγοντα κινδύνου για την εγκατάσταση λανθάνουσας EBV λοίμωξης και την έκφραση της LMP-1.Β. Συσχέτιση του ιού και της έκφρασης της LMP-1 με τα επίπεδα της survivin, ενός μέλους τηςοικογένειας των αναστολέων της απόπτωσης (ΙΑΡ) που εμπλέκεται στην ανάπτυξη νεοπλασιών. Τα επίπεδα του mRNA της survivin μετρήθηκαν σε 64 ασθενείς και βρέθηκαν 8,37 φορές υψηλότερα στους EBV- ασθενείς (ρ=0,002) και 6,36 φορές υψηλότερα στους LMP-1 αρνητικούς ασθενείς (ρ=0,008), γεγονός που υποδηλώνει «παραδόξως» υπερίσχυση των αποπτωτικών δράσεων της LMP-1.Γ. Διερεύνηση της δράσης της ριτουξιμάμπης στο ιικό φορτίο του EBV σε 44 ασθενείς που έλαβαν ανοσοχημειοθεραπεία. Από τους 17 EBV+ ασθενείς, μόνο ένας ασθενής είχε ανιχνεύσιμο ιικό φορτίο μετά τη θεραπεία, ήταν δε ο μόνος ασθενής που δεν ανταποκρίθηκε στη θεραπεία. Η ριτουξιμάμπη εκριζώνει τον EBV από το αίμα, παρότι προκαλεί αναζωπύρωση άλλων ιογενών λοιμώξεων, γεγονός με ποικίλες προεκτάσεις που μένουν να διερευνηθούν στο μέλλον.