Η συμβολή δίαιτας ελλειπούς σε χολίνη στον πειραματικώς επαγόμενο σακχαρώδη διαβήτη σε επίμυες.

Abstract

Diabetes Mellitus (DM) is a group of metabolic disorders sharing a common phenotype of hyperglycemia. The metabolic dysregulation related with DM induces secondary pathophysiological alterations in multiple systems leading to metabolic and biological disruptions and histological lesions. Choline (Ch), a B vitamin co-factor, has been identified as an essential nutrient with crucial role in many vital biological functions. It is essential for the structural integrity of the cell membrane and also the transmembranic signaling through the production of secondary messengers. Choline deficiency (CD) can lead to developmental abnormalities, memory disruption, hepatocellular lesions or even oncogenesis in the liver. CD is a common problem met in clinical conditions such as alcoholism, malnutrition, pregnancy and lactation.AIMAim of the study was to investigate the impact of dietary Ch deprivation in a substrate of STZ- induced DM in adult rats. We have searched for potential alterations induced by Ch-deficient diet (CDD) in the changes caused by DM in organs and tissues of rats, especially in the brain, the liver, and adipose tissue and in serum biological parameters.METHODSMale Wistar rats (n=48) age about four months old were randomized into four groups: control (C), STZ induced diabetic (D), Ch-deprived (CD), and Ch-deprived diabetic (D+CD). Deprivation of Ch was provoked through the administration of CDD. Both the induction of DM and the beginning of dietary-mediated provoking of Ch-deprivation occurred at the same day, and rats were killed by decapitation after 30 days and 60 days. We examined the activity of AchE, Na+,K+-ATPase and Mg2+-ATPase in the brain, the expression of MMP-2 and 9, TIMP-1 and 2, GLUT-2 and 4, IRS-1 and IR in the liver, the histopathological lesions in the liver, the leptin, adiponectin, and resistin expression in the adipose tissue and the lipid profile, the liver function tests and the levels of glucose and insulin in the serum at 30 and 60 days of the experiment in order to elucidate the influence of a CDD on the STZ induced DM in the rats.RESULTSThe CD+D group showed high mortality rates (40% in the second month) due to the high toxicity of the combination of a CDD in a diabetic substrate. Also the body weights in this group were less than in the other groups at both months (+20,7% vs +52% in the first month, +1,3% vs 62% in the second). Histological examination of the CDD+D liver sections revealed high grade liposis, in mainly microvescicular, with intense ballooning degeneration. These findings worsened in the second month of the experiment, with liposis becoming macrovescicular. About Liver Function Tests, SGOT and SGPT were significantly increased only by the end of the second month, while γGT and ALP were both statistically increased at both the end of the first and the second month. MMP-2 expression in the liver was non statistically increased in the first month and reduced in the second. MMP-9 expression was increased versus control group by the end of both months, statistically significantly only by the end of the first month. ΤΙΜΡ-1 and 2 expression was slightly upregulated in the combination group by the end of both one and two months. About the lipid profile, serum Triglicerides, Total Cholesterol and HDL were all significantly higher in the CD+D group versus the C group at both the end of the first and the second month. Random serum glucose levels were significantly higher in the CD+D group in the first month, even higher than the D group, but were significantly lower versus the D group by the end of second month. This could mean that CD may enhance glucose tolerance. Fasting serum insulin was significantly lower by the end of second month in the CD+D group versus all other groups (p<0.05). This, in combination with glucose levels that confirm the successful DM induction by STZ, could mean that there was a degree of residual activity of β-cells that secrete insulin inadequately in response to the gradually higher hyperglycemia and also that there was a possible attenuation of the insulin resistance by the CDD. This can be attributed to the sensitized, by CDD, hepatic insulin signaling pathways. GLUT-2 expression in the liver was significantly upregulated (p<0.001) versus C and D groups at both one and two months. IRS-1 and IR expression was also significantly upregulated in the CDD+DM group in both months. GLUT-4 expression on the adipose cells of the liver was upregulated in the CD+D group significantly (p<0.001) versus the C and D groups at both months, due to the fatty liver caused by the CDD.Adiponectin expression in adipose tissue was slightly increased in both months. Leptin expression was upregulated in the first month, but downregulated in the second. Resistin expression was upregulated in both months. The Ch-deprived diabetic rats' brain AChE activity was significantly altered only after a 60-day period of exposure, resulting in a +27% increase (p < 0.001). CD+D group also exhibited a statistically significant decrease in brain Na+,K+ -ATPase activity only in the end end of the second month (-22%, p < 0.01). As concerns Mg2+ -ATPase, the enzyme's activity demonstrates significant increase only by the end of second month (+21%, p < 0.05, D2+CD2 vs. C2).CONCLUSIONOur new design model of combined CD with DM resembles some common clinical conditions, such as patients with insulin dependent diabetes mellitus (IDDM) in combination with malnutrition, parenteral nutrition, pregnancy or lactation and explores the changes in organs, tissues and biochemical parameters induced by the combined effect of Ch deficiency and DM by the end of one and two months of experiment.Our study suggests that CD enhances glucose tolerance in diabetic substrate, attenuating insulin resistance and thus the hyperglycemic response caused by STZ, but at the same time increasing the hepatotoxic and destructive effects of the combination of CDD and DM. Moreover, this combination augmented the features of metabolic syndrome, which is usually simulated by the CD models, by upregulating the expression of Resistin mRNA in adipose tissue and promoting the progressive hyperlipidemia, but with simultaneous weight loss. Our data indicate that Ch-deprivation seems to be an undesiderable background for the above-mentioned enzymatic activities in the brain under untreated diabetes, in a time-evolving way. Further investigations are necessary, in order to elucidate the underlying mechanisms involved in this experimental model and contribute to the search of therapeutic applications for the clinical conditions this model simulates.

Ο ΣΔ αναφέρεται σε μια ομάδα συχνών μεταβολικών διαταραχών με κοινό φαινότυπο την υπεργλυκαιμία. Η μεταβολική απορρύθμιση που σχετίζεται με το ΣΔ προκαλεί δευτεροπαθείς παθοφυσιολογικές μεταβολές σε πολλαπλά οργανικά συστήματα και οδηγεί σε διαταραχές μεταβολικές, βιοχημικές και ιστολογικές.Η χολίνη είναι μία τεταρτοταγής κεκορεσμένη αμίνη. Αποτελεί απαραίτητο διαιτητικό στοιχείο, σημαντικό για την φυσιολογική λειτουργία όλων των κυττάρων. Μαζί με τους μεταβολίτες της διαδραματίζει καθοριστικό ρόλο στη δομική ακεραιότητα της κυτταρικής μεμβράνης, καθώς και στη διαμεμβρανική μεταβίβαση σημάτων μέσω της παραγωγής δεύτερων μηνυμάτων (συστατικό φωσφολιπιδίων της μεμβράνης). Η αποστέρηση Ch δυνατόν να οδηγήσει σε αναπτυξιακές διαταραχές, διαταραχές μνήμης, ηπατοκυτταρικές αλλοιώσεις, ακόμα και σε ογκογένεση στο ήπαρ. Η ανεπάρκεια Ch αποτελεί συχνό πρόβλημα σε κλινικές καταστάσεις, καθώς δύναται να συνοδεύει ποικίλες παθολογικές (αλκοολισμό, κακή θρέψη) ή φυσιολογικές καταστάσεις (εγκυμοσύνη, γαλουχία).ΣΚΟΠΟΣΗ μελέτη αυτή σχεδιάσθηκε ώστε να διερευνήσει επιπτώσεις δίαιτας ελλειπούς σε χολίνη (CDD) σε ενήλικες επίμυες οι οποίοι είχαν υποβληθεί σε πειραματικώς επαγόμενο ΣΔ με στρεπτοζοκίνη (STZ). Ιδιαίτερη έμφαση δόθηκε σε χρονοεξαρτώμενες μεταβολές μετά απο 30 και 60 ημέρες χορήγησης δίαιτας CDD σε ενζυμικές δραστικότητες στον εγκέφαλο και σε παθολογοανατομικές και λειτουργικές διαταραχές στο ήπαρ.ΜΕΘΟΔΟΣΧρησιμοποιήθηκαν 48 άρρενες επίμυες Wistar Albino (ηλικίας τεσσάρων μηνών, βάρους 240± 26 g). Τυχαιοποιήθηκαν σε τέσσερις ομάδες : ομάδα C (Control): Ομάδα ελέγχου, διατροφή με ισορροπημένη δίαιτα, ομάδα D (Diabetic): Επαγωγή ΣΔ με χορήγηση STZ και διατροφή με ισορροπημένη δίαιτα, ομάδα CD (Ch-deprived): Διατροφή με δίαιτα CDD, ομάδα CD+D (Ch-deprived diabetic): Επαγωγή ΣΔ με χορήγηση STZ και διατροφή με CDD. Η επαγωγή ΣΔ έγινε με μια και μοναδική ενδοπεριτοναϊκή ένεση STZ (50 mg/kg ΒΣ). Έξι επίμυες θανατώθηκαν από κάθε ομάδα στις 30 ημέρες (1ος μήνας- ομάδες C1, D1, CD1 και D1+CD1) και έξι στις 60 ημέρες (2ος μήνας- ομάδες C2, D2, CD2 και D2+CD2). Δύο επίμυες (ένας από την ομάδα D2 και ένας από την D2+CD2) δεν έγιναν διαβητικοί και εξαιρέθηκαν από το πείραμα. Από κάθε ομάδα θυσιάστηκαν 6 επίμυες στο τέλος της 4ης εβδομάδας και 6 επίμυες στο τέλος της 8ης εβδομάδας. Στους επίμυες έγινε αιμοληψία από την κάτω κοίλη φλέβα και αφαίρεση του ήπατος, του εγκεφάλου και του περινεφρικού λίπους, για περαιτέρω μελέτη. Οι σημαντικότερες επιδράσεις της CDD αφορούν κυρίως στο ΚΝΣ και στο ήπαρ και για το λόγο αυτό τα πειράματά μας εστίασαν στον εγκέφαλο και στο ήπαρ. Στον ορό έγινε προσδιορισμός των βιοχημικών παραμέτρων: σακχάρου, ινσουλίνης, τριγλυκεριδίων, ολικής χοληστερόλης, HDL χοληστερόλης, τρανσαμινασών (SGOT και SGPT), γ-GT, ALP, ολικών λευκωμάτων, αλβουμίνης και σφαιρινών. Στον εγκέφαλο μετρήθηκαν η δραστικότητες σημαντικών ενζύμων της Ακετυλοχολινεστεράσης, της Na+,K+-ATPάσης και της Mg2+-ATPάσης. Οι μελέτες στο ήπαρ περιέλαβαν ιστολογική εξέταση για τυχόν αλλοιώσεις, καθώς και τη ποιοτική μέτρηση και έκφραση των μεταλλοπρωτεϊνασών του υποστρώματος MMP-2 και MMP-9, και των ιστικών αναστολέων τους TIMP-1 και TIMP-2. Επιπλέον διερευνήθηκαν τυχόν μεταβολές στο μονοπάτι της ινσουλίνης στο ηπατικό κύτταρο, και πιο συγκεκριμένα μελετήθηκε η έκφραση του υποδοχέα της ινσουλίνης ΙR και του υποστρώματος του (IRS-1), μεταφορέων της γλυκόζης GLUT-2 και GLUT-4, ενώ έγινε και ποσοτικός προσδιορισμός της υπομονάδος β του υποδοχέα (IRβ) (Western Blot) . Στον λιπώδη ιστό με PCR μελετήθηκε η έκφραση των επιπέδων ρεζιστίνης, αδιπονεκτίνης και λεπτίνηςΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑΗ ομάδα επιμύων με έλλειψη χολίνης και πειραματικώς επαγόμενο ΣΔ με STZ (CD+D), παρουσίασε μεγάλα ποσοστά θνητότητας (36% στον δεύτερο μήνα) λόγω της μεγάλης τοξικότητας που προκαλεί η συνύπαρξη ΣΔ και έλλειψης Ch. Τα σωματικά τους βάρη ήταν χαμηλότερα από τις υπόλοιπες ομάδες και στους δύο μήνες του πειράματος (+20,7% έναντι +52% τον πρώτο μήνα, +1,3% έναντι 62% τον δεύτερο). Το λιπιδαιμικό προφίλ στην ομάδα CD+D, τόσο τα τριγλυκερίδια, όσο και η ολική χοληστερόλη, αλλά και η HDL χοληστερόλη αυξήθηκαν σημαντικά και στους δύο μήνες σε σχέση με την ομάδα ελέγχου.Η ιστοπαθολογική μελέτη του ήπατος στην ομάδα CD+D έδειξε κατάτον πρώτο μήνα έντονη λιπώδη διήθηση με εικόνα κυρίως μικροφυσαλιδώδη, με έντονο το φαινόμενο της διαυγοκυτταρικής διόγκωσης (ballooning degeneration). Το δεύτερο μήνα εμφανίστηκε επιδεινωμένη εικόνα λίπωσης με επικράτηση της μακροφυσαλιδώδους μορφής. Τα ηπατικά ένζυμα στην ομάδα CD+D, τόσο η SGOT, όσο και η SGPT παρουσίασαν στατιστικά σημαντική αύξηση σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου μόνο τον δεύτερο μήνα του πειράματος, ενώ η γ-GT, και η ALP, αυξήθηκαν στατιστικά σημαντικά και στους δυο μήνες σε σχέση με τις αντίστοιχες ομάδες ελέγχου. Οι ολικές πρωτεΐνες δεν παρουσίασαν αξιόλογες μεταβολές, η ALB στον δεύτερο μήνα παρουσίασε σημαντική αύξηση σε σύγκριση με την ομάδα διαβητικών (p<0.05). Οι σφαιρίνες στην ομάδα CD+D μειώθηκαν και στους δυο μήνες με στατιστική σημασία τον πρώτο σε σχέση με την ομάδα ελέγχου C1 (p<0.05) και σε σχέση με την ομάδα διαβητικών D1 (p<0.05). Το λευκωματικό πηλίκο, αυξήθηκε στην ομάδα CD+D και στους δύο μήνες, με στατιστική σημασία τον πρώτο, τόσο σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου C1, όσο και σε σχέση με την ομάδα διαβητικών D1 (p<0.01). Η MMP-2 στην ομάδα CD+D αυξήθηκε τον πρώτο μήνα και μειώθηκε το δεύτερο χωρίς στατιστική σημασία πάντα σε σχέση με την ομάδα ελέγχου, η MMP-9 αυξήθηκε και στους δύο μήνες στην ομάδα CD+D με στατιστική σημασία τον πρώτο μήνα (p<0.001). Οι αναστολείς ΤΙΜΡ-1 και 2 στην ομάδα CD+D παρουσίασαν μικρή αυξητική ρύθμιση και στους δύο μήνες του πειράματος σε σχέση με τις ομάδες ελέγχου.Στην ομάδα διαβητικών επίμυων με έλλειψη χολίνης, η δραστικότητα της AChE στον εγκέφαλο αυξήθηκε στατιστικά σημαντικά σε σχέση με την ομάδα ελέγχου μόνο στους 2 μήνες του πειράματος (+27%, p<0.001). Στην ομάδα συγχορήγησης στατιστικά σημαντικά ελαττώθηκε η δραστικότητα της Na+, K+-ATPάσης στο τέλος του δεύτερου μήνα σε σχέση με την ομάδα ελέγχου (-22%, p<0.01). Η δραστικότητα της Mg2+ -ATPάσης αυξάνεται στατιστικά σημαντικά μόνο στο τέλος του δεύτερου μήνα του πειράματος σε σχέση με την ομάδα ελέγχου (+21%, p<0.05). Οι μετρήσεις γλυκόζης έδειξαν ακραία υψηλές τιμές στην ομάδα CD+D, με περεταίρω αύξηση σε σχέση με την ομάδα των διαβητικών τον πρώτο μήνα, ενώ τον δεύτερο μήνα υπάρχει ελάττωση των τιμών της γλυκόζης στην ομάδα CD+D σε σχέση με την ομάδα D, πράγμα που μπορεί να σημαίνει ότι η έλλειψη χολίνης αυξάνει την ανοχή στη γλυκόζη. Στο πείραμα μας μετρήθηκε η ινσουλίνη νηστείας ορού στις 60 ημέρες από την επαγωγή με STZ ΣΔ. Η ινσουλίνη νηστείας ορού βρέθηκε στατιστικά σημαντικά ελαττωμένη (p<0.05) μόνο στην ομάδα διαβητικών με έλλειψη χολίνης CD+D συγκριτικά με όλες τις υπόλοιπες ομάδες. Αυτό σε συνδυασμό με τις μετρήσεις γλυκόζης που επιβεβαιώνουν την επιτυχή επαγωγή ΣΔ στις ομάδες των διαβητικών D όσο και στην ομάδα διαβητικών με έλλειψη χολίνης CD+D, δείχνουν την ύπαρξη υπολειπόμενης λειτουργίας β-κυττάρων, που εκκρίνουν ινσουλίνη αποκρινόμενα ανεπαρκώς στην προοδευτικά επιδεινούμενη υπεργλυκαιμία, καθώς και την πιθανή εξασθένιση της αντίστασης στην ινσουλίνη από την επίδραση της CDD. Αυτό επιτυγχάνεται μέσω της ευαισθητοποίησης από τη στέρηση χολίνης της οδού μετάδοσης του σήματος της ινσουλίνης. Πιο συγκεκριμένα ο μεταφορέας γλυκόζης GLUT-2 στο ήπαρ στην ομάδα CD+D αυξάνει την έκφραση του και στους δυο μήνες με στατιστική σημασία, τόσο απέναντι στις αντίστοιχες ομάδες ελέγχου (p<0.001), όσο και απέναντι στις αντίστοιχες ομάδες διαβητικών. Ο GLUT-4 που αφορά τα λιποκύτταρα του ήπατος επίσης αυξάνεται στην ομάδα CD+D και στους δυο μήνες με στατιστική σημασία απέναντι στις αντίστοιχες ομάδες ελέγχου (p<0.001) και απέναντι στις αντίστοιχες ομάδες διαβητικών, πιθανώς λόγω της έντονης λιπώδους διήθησης του ήπατος. Αύξηση της έκφρασης του υποστρώματος του υποδοχέα ινσουλίνης IRS-1 στην ομάδα διαβητικών με έλλειψη χολίνης CD+D παρατηρείται και στους δύο μήνες, όπως και της έκφρασης και του ίδιου του υποδοχέα IR. Η ποσοτική μέτρηση του υποδοχέα της ινσουλίνης IRβ έδειξε αύξηση στην ομάδα CD+D στον πρώτο μήνα και μείωση στον δεύτερο σε σχέση με την ομάδα ελέγχου, ενώ το πρόδρομο μόριο του υποδοχέα IR-PRO στην ομάδα CD+D μειώνεται και στους δύο μήνες, χωρίς στατιστική σημασία σε σχέση με την ομάδα ελέγχου. Στο λιπώδη ιστό η αδιπονεκτίνη στην ομάδα CD+D αυξήθηκε σε μικρό βαθμό και στους δυο μήνες. Η έκφραση της λεπτίνης και της ρεζιστίνης αυξήθηκαν τον πρώτο μήνα. Αντίθετα το δεύτερο μήνα η έκφραση της λεπτίνης ελαττώνεται, ενώ της ρεζιστίνης αυξάνεται σε σχέση με την ομάδα ελέγχου. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΗ μελέτη επικεντρώθηκε στην ιδέα επαγωγής ΣΔ σε επίμυες με ταυτόχρονη διατροφική έλλειψη Ch και μελετήθηκαν οι μεταβολές που επέρχονται μετά από ένα και μετά από δύο μήνες σε συγκεκριμένες παραμέτρους στο ήπαρ και στον εγκέφαλο. Ο συνδιασμός έλλειψης χολίνης με σακχαρώδη διαβήτη μπορεί να αποτελεί ένα δυναμικό πειραματικό μοντέλο που προσομοιώνει συχνές κλινικές καταστάσεις, όπως άτομα με ΣΔ και ταυτόχρονη κακή θρέψη, παρεντερική σίτιση, εγκυμοσύνη ή θηλασμό κτλ.Η χολίνη φαίνεται να ευαισθητοποιεί την οδό μετάδοσης του σήματος της ινσουλίνης στο ήπαρ ανεξάρτητα από την ύπαρξη σακχαρώδους διαβήτη, μειώνοντας την υπεργλυκαιμική απάντηση που προκαλείται από την στρεπτοζοκίνη. Επιλέον η αντιδιαβητική δράση της έλλειψης χολίνης συμπερένεται και απο την ενίσχυση της ανασταλτικής δράσης της υπεργλυκαιμίας στον GLUT-2. Ο συνδιασμός χολίνης και σακχαρώδους διαβήτη δίνει εικόνα μεταβολικού συνδρόμου αλλά με ηπατοτοξική και καταστροφική δράση, προάγοντας προοδευτική δυσλιπιδαιμία με ταυτόχρονη μείωση του βάρους. Τα δεδομένα της διατριβής επίσης κάνουν εμφανές το γεγονός ότι η έλλειψη Ch σε συνδυασμό με τον ΣΔ αποτελούν ανεπιθύμητο υπόστρωμα, για τις ενζυμικές δραστικότητες που μελετήσαμε στο εγκέφαλο και οι επιπτώσεις τους είναι εξαρτώμενες από το χρόνο. Περαιτέρω μελέτες θα χρειαστούν για την αποσαφήνιση των μηχανισμών που ενέχονται σε αυτό το πειραματικό μοντέλο, ώστε να βοηθηθεί η αναζήτηση θεραπευτικών εφαρμογών για τις κλινικές προεκτάσεις του.