Μελέτη παθογενετικής σημασίας διαφόρων παραμέτρων λοιμώξεως από ιό των θηλωμάτων του ανθρώπου (HPV) στην ανάπτυξη καρκίνου του τραχήλου της μήτρας: πρόδρομες αλλοιώσεις και διηθητικό καρκίνωμα

Abstract

Cervical cancer is the second most common type of cancer in women worldwide. High-risk human papillomavirus (HR-HPV) persistent infection is the main causative agent. The HPV-induced process of tumorigenesis is associated with well-defined clinical stages, each with unique features. HR-HPV types are present in over than 99% of cervical cancers and in the vast majority of cases with high grade cervical intraepithelial neoplasia. Therefore, it has been suggested that HPV detection might be a useful tool in identification of women who are at risk to develop cervical cancer, in addition to Pap smears. In recent years, research is being focused on both the development of HPV vaccines crucial for the prevention of cervical disease and the identification of molecular markers to be used as potential screening tools in the early detection of cervical cancer precursors. HPV type distribution presents geographical heterogeneity and most of the studies are related to HPV 16 type. Therefore, in our study we evaluated the prevalence of HPV infection among 134 Greek women with Pap test abnormalities, who visited the external colposcopy clinic of the University General Hospital of Larissa between 2008 and 2010. The majority of the women completed a questionnaire about their age, educational level, smoking habits, previous abnormal Pap test or previous infection from HPV virus or Chlamydia trachomatis. Both cervical smears and biopsies were collected. A biopsy sample was not collected from 11 women, thus they were excluded from the study. Biopsies were histological diagnosed and 3 women diagnosed with inflammation and 2 more having only endocervical mucosa in their biopsy were further excluded. Biopsies and cervical smears were further analyzed for HPV presence. DNA was extracted and PCR amplification was performed. A specific L1 HPV region was amplified with consensus PGMY primer set. Specific primers for low-risk HPV types 6, 11 and high-risk HPV types 16, 18, 31 and 33 were also used. Immunohistochemistry (IHC) was also performed in order to evaluate expression patterns of p16, cyclin B1 and MIB-1 markers. These cellular proteins are thought to be surrogate biomarkers for persistent infection with high-risk HPV viruses. Statistical analysis of the questionnaires did not reveal significant associations (p< 0.05 was considered statistically significant) for any of the parameters included except for smoking habits. High grade dysplasia lesions were much more frequent in smokers than non smokers (p=0,020). However, in a multiple logistic regression model, evaluating all parameters, smoking cease to be statistically important, supporting its synergistic action to the existing HPV infection.Based on histological diagnosis 87 women had low grade squamous intraepithelial lesion (LGSIL), 28 women showed high grade squamous intraepithelial lesion (HGSIL) and 3 women had cancer. HPV virus was present in 90,81% of LGSIL samples (79/87 women). HPV was present in all HGSIL and cancer cases. 110/118 samples (93,22%) were HPV positive. Positive samples were further analyzed for HPV typing. In both LGSIL and HGSIL biopsies the most common HPV types were 16, 18, 31 and 33. Low-risk 6, 11 HPV types were also present at multiple infections. It is worth mentioning that HPV51 was present in LGSILs, while HPV59 was more frequent in HGSIL cases. We also examined the frequency of simple and multiple HPV infections in our samples. In our study, 21% of LGSIL cases showed multiple infections, while in HGSIL cases almost half of them had multiple HPV infection. Differences in the frequencies of simple and multiple HPV infections have been mentioned before suggesting that both geographical heterogeneity and different methodological approaches could be responsible. Multiple HPV infections are more frequent in women aged less than 35 years old. Immunohistochemistry was performed for p16, cyclin-B1 and MIB-1 evaluation. Samples positive for p16 staining were classified in four groups (patterns A, A low, B, C). 78,2% of LGSIL and 96,43% of HGSIL cases and all 3 of the cancers showed positive p16 staining. However, there were differences in the expression patterns, since the majority of LGSIL cases showed focal p16 staining (A, A low patterns), while diffuse staining (patterns B, C) was present in 92,86% of HGSIL cases and in 100% of cancers. Samples were classified in three groups (patterns A, B, C) for cyclin-B1 evaluation. Pattern A was characterized as negative, while patterns B, C were characterized as positive. 94,07% of the samples showed positive staining for cyclin- B1. All HGSIL cases and cancers showed B and C patterns for cyclin-B1. In LGSIL cases, positive staining for cyclin-B1 was present in 91,95% (80/87 women). The majority of LGSIL cases showed pattern B, while the majority of HGSIL cases showed pattern C.For MIB-1 staining evaluation, samples were also classified in three groups (patterns 1/3, 2/3, 3/3). LGSIL cases presented mostly pattern 1/3, while the majority of HGSIL cases presented patterns 2/3 and 3/3. All 3 cancers showed pattern 3/3 for MIB-1 staining. Statistical analysis of the results obtained by immunohistochemistry showed significant correlations between p16 (pattern C), cyclin-B1 (pattern C) and MIB-1 (pattern 3/3) staining and the degree of dysplasia (HGSIL cases) (p<0,05). Correlations between p16, cyclin-B1 and MIB-1 protein expression patterns with HPV presence were further evaluated. Statistical analysis revealed significant correlation between diffuse p16 staining (pattern C) and multiple HPV infection (p=0,005), as well as with HPV16 type (p=0,015). Correlation between cyclin-B1 staining (patterns B, C) and multiple HPV infection showed analogous results (p=0,04). There was no significant correlation for cyclin B1 staining and high-risk HPV types such as HPV16, HPV18 (p=0,105). Finally, MIB-1 pattern 1/3 was present mostly in simple infections (p=0,001) and there was no significant correlation between MIB-1 immunostaining and high-risk HPV16 and HPV18 types (p=0,085). However, evaluation in a larger group is needed.In conclusion, ιmmunostaining for p16, cyclin-B1 and MIB-1 seems to have a supportive role in histological diagnosis which remains the “gold standard” in the evaluation of cervical lesions so that patients receive appropriate treatment.

Ο καρκίνος του τραχήλου της μήτρας είναι η δεύτερη πιο συχνή μορφή καρκίνου που εμφανίζεται στις γυναίκες παγκοσμίως. Η εμμένουσα λοίμωξη από στελέχη υψηλού κινδύνου του ιού HPV (HR-HPV) αποτελεί την κύρια αιτία. Η διαδικασία της ογκογένεσης που προκαλείται από τον HPV συνδέεται με καθορισμένα στάδια, με μοναδικά χαρακτηριστικά το καθένα. Τα στελέχη υψηλού κινδύνου βρίσκονται σε ποσοστό πάνω από 99% στους καρκίνους του τραχήλου της μήτρας και στην πλειονότητα των περιπτώσεων ενδοεπιθηλιακής νεοπλασίας υψηλού βαθμού. Επομενως, εκτός από το τεστ Παπανικολάου, έχει προταθεί ότι η ανίχνευση του HPV μπορεί να είναι ένα χρήσιμο εργαλείο στην ταυτοποίηση των γυναικών που βρίσκονται σε κίνδυνο να αναπτύξουν καρκίνο του τραχήλου της μήτρας.Τα τελευταία χρόνια η έρευνα επικεντρώνεται τόσο στην δημιουργία εμβολίων του ιού HPV, που είναι ζωτικής σημασίας για την πρόληψη του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας, όσο και στον προσδιορισμό μοριακών δεικτών που θα χρησιμοποιηθούν ως πιθανά εργαλεία διαλογής στην πρώιμη ανίχνευση των πρόδρομων αλλοιώσεων στον τράχηλο της μήτρας. Η κατανομή των διαφόρων στελεχών του ιού παρουσιάζει γεωγραφική ετερογένεια και οι περισσότερες μελέτες αφορούν το στέλεχος 16 του ιού.Στην παρούσα μελέτη εκτιμήθηκε η παρουσία της HPV λοίμωξης σε 134 γυναίκες που προσήλθαν στο τμήμα Κολποσκόπησης του Πανεπιστημιακού νοσοκομείου Λάρισας, με παθολογικό τεστ Παπανικολάου, το χρονικό διάστημα 2008-2010. Η πλειοψηφία των γυναικών συμπλήρωσε ερωτηματολόγιο που αφορούσε την ηλικία τους, το μορφωτικό τους επίπεδο, το κάπνισμα, προηγούμενη λοίμωξη από ιό HPV ή από χλαμύδια (Chlamydia trachomatis). Ακολούθησε η λήψη τραχηλικού επιχρίσματος και βιοψίας. Σε 11 γυναίκες δεν έγινε λήψη βιοψίας και επομένως οι γυναίκες αυτές αποκλείστηκαν από τη μελέτη. Ακολούθησε η ιστολογική διάγνωση των βιοψιών. Με βάση την ιστολογική διάγνωση αποκλείστηκαν επιπλέον 3 γυναίκες καθώς η ιστολογική διάγνωση έδειξε φλεγμονή και ελάχιστο ή ανύπαρκτο επιθήλιο, ενώ 2 ακόμη εξαιρέθηκαν από τη μελέτη, καθώς η βιοψία τους περιλάμβανε ενδοτραχηλικό βλεννογόνο. Κατόπιν, έγινε απομόνωση DNA και μοριακή ανάλυση των δειγμάτων με την αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR). Η περιοχή L1 του ιού ανιχνεύτηκε με τη χρήση PGMY εκκινητών. Ειδικοί εκκινητές χρησιμοποιήθηκαν για τα στελέχη χαμηλού κινδύνου HPV 6,11 και για τα στελέχη υψηλού κινδύνου του HPV 16, 18, 31, 33. Επιπλέον, πραγματοποιήθηκε ανοσοϊστοχημεία (IHC), προκειμένου να εκτιμηθεί το πρότυπο έκφρασης των δεικτών p16, κυκλίνης-B1 και MIB-1. Οι χρώσεις αυτές αποτελούν υποβοηθητικούς δείκτες στη εμμένουσα λοίμωξη από στελέχη υψηλού κινδύνου του ιού. Η στατιστική ανάλυση του ερωτηματολογίου δεν ανέδειξε στατιστικά σημαντική συσχέτιση (p<0,05 θεωρείται στατιστικά σημαντική), για καμία από τις παραμέτρους που συμπεριλήφθησαν εκτός του καπνίσματος. Αλλοιώσεις με υψηλόβαθμη δυσπλασία παρατηρήθηκαν με μεγαλύτερη συχνότητα στις καπνίστριες σε σχέση με τις μη καπνίστριες(p=0,020). Εντούτοις, σε μοντέλο πολλαπλής λογιστικής αναλυσης, εκτιμώντας όλες τις παραμέτρους, το κάπνισμα εξακολουθεί να δρα συνεργατικά στη HPV λοίμωξη. Με βάση την ιστολογική διάγνωση 87 γυναίκες εμφάνισαν LGSIL αλλοιώσεις, 28 γυναίκες εμφάνισαν ΗGSIL αλλοιώσεις ενώ 3 γυναίκες εμφάνισαν καρκίνο. Παρουσία του ιού HPV ανιχνεύτηκε σε ποσοστό 90,81% των LGSIL αλλοιώσεων(79/87 γυναίκες) Ο ιός HPV ανιχνεύτηκε σε όλες τις ΗGSIL αλλοιώσεις καθώς και σε όλα τα δείγματα με καρκίνο. Σε 110/118 περιστατικά ( 93,22%) παρατηρήθηκε θετικότητα για τον ιό. Στα θετικά δείγματα ακολούθησε τυποποίηση του ιού Τόσο στις LGSIL αλλοιώσεις, όσο και στις ΗGSIL αλλοιώσεις τα πιο συχνά στελέχη του ιού που ανιχνεύτηκαν ήταν τα:16,18,31 και 33. Τα στελέχη χαμηλού κινδύνου του ιού HPV 6,11 ανιχνεύτηκαν σε πολλαπλές λοιμώξεις. Αξίζει να σημειωθεί η παρουσία του στελέχους HPV51 στις LGSIL αλλοιώσεις και του στελέχους HPV59 στις αλλοιώσεις ΗGSIL. Επίσης, εξετάσαμε τη συχνότητα των μονών και των πολλαπλών λοιμώξεων στα δείγματα μας. Στην παρούσα μελέτη σε ποσοστό 21% των LGSIL αλλοιώσεων παρατηρήθηκαν πολλαπλές λοιμώξεις, ενώ όσον αφορά τις ΗGSIL αλλοιώσεις, στις μισές περίπου παρατηρήθηκαν πολλαπλές λοιμώξεις.Διαφορές ως προς τη συχνότητα μεταξύ μονών και πολλαπλών λοιμώξεων έχουν επισημανθεί, ανεξάρτητα από την άποψη ότι τόσο η γεωγραφική ετερογένεια, όσο και οι διαφορετικές μέθοδοι μπορεί να ευθύνονται ως προς αυτή τη κατεύθυνση. Πολλα-λες λοιμώξεις παρατηρήθηκαν σε γυναίκες ηλικίας κάτω των 35 ετών. Στη συνέχεια έγινε εκτίμηση των ανοσοϊστοχημικών δεικτών p16, κυκλίνης-B1 και MIB-1 Τα δείγματα που ανέδειξαν θετική χρώση p16 ταξινομήθηκαν σε 4 κατηγορίες ( πρότυπο A, A low, B, C). Θετική χρώση για p16 παρατηρήθηκε στο 78,2% των LGSIL, στο 96,43% των ΗGSIL ,καθώς και στους 3 καρκίνους. Ωστόσο παρατηρήθηκαν διαφορές στα πρότυπα έκφρασης ,αφού στην πλειονότητα των LGSIL παρατηρήθηκε εστιακή χρώση για p16(πρότυπο A, A low), ενώ διάχυτη χρώση (πρότυπο, B, C) παρατηρήθηκε στο 92,86% των ΗGSIL και στο 100% των καρκίνων. Για την εκτίμηση της κυκλίνης-Β1 τα δείγματα ταξινομήθηκαν σε 3 κατηγορίες (πρότυπο A, B, C) Το πρότυπο Α χαρακτηρίστηκε αρνητικό, ενώ το πρότυπο Β και C θετικό. Σε ποσοστό 94,07 % των δειγμάτων παρατηρήθηκε θετική χρώση για κυκλίνη-Β1. Όλες οι ΗGSIL αλλοιώσεις και οι καρκίνοι ανέδειξαν πρότυπο Β και C για την κυκλίνη-Β1. Στις LGSIL αλλοιώσεις παρατηρήθηκε θετική χρώση σε ποσοστό 91,95% (80/87 γυναίκες). Η πλειονότης των LGSIL αλλοιώσεων ανεδειξαν πρότυπο B,ενώ αντίστοιχα των ΗGSIL πρότυπο C. Για την εκτίμηση του δείκτη κυτταρικού πολλαπλασιασμού MIB-1 τα δείγματα ταξινομήθηκαν σε 3 κατηγορίες (πρότυπο 1/3, 2/3, 3/3). Στις LGSIL αλλοιώσεις παρατηρήθηκε πρότυπο 1/3, ενώ η πλειονότητα των ΗGSIL αλλοιώσεων ανέδειξε πρότυπο 2/3 και 3/3. Όλοι οι καρκίνοι ανέδειξαν πρότυπο 3/3. Η στατιστική ανάλυση των ανοσοϊοστοχημικών αποτελεσμάτων έδειξε στατιστικά σημαντική συσχέτιση μεταξύ των δεικτών p16 (πρότυπο C) , κυκλίνης-B1(πρότυπο C) και MIB-1 (πρότυπο 3/3) και της δυσπλασίας υψηλού βαθμού (HGSIL cases) (p<0,05). Συσχετίσεις μεταξύ της έκφρασης των ανοσοϊστοχημικών δεικτών p16, κυκλίνης-B1 και MIB-1 και της παρουσίας του ιού HPV μελετήθηκαν περαιτέρω. Η στατιστική ανάλυση ανέδειξε σημαντική συσχέτιση μεταξύ διάχυτης χρώσης p16, (πρότυπο C) και πολλαπλής λοίμωξης(p=0,005), καθώς με το στέλεχος HPV16 (p=0,015). Η συσχέτιση κυκλίνης-Β1(πρότυπο Β, C) και πολλαπλής λοίμωξης έδειξε ανάλογα αποτελέσματα(p=0,04). Δεν υπήρξε στατιστικά σημαντική συσχέτιση ανάμεσα στην κυκλίνη-Β1και στα στελέχη υψηλού κινδύνου όπως των HPV 16, HPV18(p=0,105).Τελικά το πρότυπο 1/3 της χρώσης MIB-1 παρατηρήθηκε ως επί το πλείστον στις μονές λοιμώξεις(p=0,001) και δεν παρατηρήθηκε σημαντική συσχέτιση μεταξύ του MIB-1 Β1και στα στελέχη υψηλού κινδύνου όπως των HPV 16, HPV18(p= 0,085). Ωστόσο η αξιολόγηση περίστερων περιπτώσεων είναι αναγκαία. Συμπερασματικά, οι ανοσοϊστοχημικοί δείκτες p16, κυκλίνη-B1 και MIB-1 φαίνεται να έχουν υποβοηθητικό ρόλο στην ιστολογική διάγνωση που παραμένει το “gold standard” στην αξιολόγηση των αλλοιώσεων του τραχήλου της μήτρας , έτσι ώστε οι ασθενείς να λαμβάνουν την κατάλληλη θεραπεία.