Βιοδιυλιστήριο για παραγωγή μονοκυτταρικής πρωτεΐνης, εδώδιμων μυκήτων και πρόσθετων τροφίμων με βιοτεχνολογική αξιοποίηση μικτών αγροτοβιομηχανικών αποβλήτων

Abstract

For the development of sustainable and environmentally friendly innovative strategies, biorefineries have a major role to a complete food, feed, chemicals, materials and fuels production. Research interest is focused on finding new cheap raw material sources due to the continuously increasing glucose prices. Among the proposed economic, sustainable and efficient raw materials, agro-industrial wastes (AIW) prevail.In the first part of the thesis a literature review is presented regarding:- Major raw materials and biorefinery processes- Microorganisms that have been exploited- Major biorefinery products- AIW and major products of their exploitationIn the second part and third part of the thesis the aims and a detailed description of the methods and materials used for the development of the experimental part are presented, respectively.The novelty of this thesis is the utilization of mixed AIW for high value-added production through biotechnological processes. The primary objective was the evaluation of mixed wastes as efficient microbial biomass production substrates of microorganisms such as Saccharomyces cerevisiae, Agaricus bisporus, Lipomyces starkeyi and the natural mixed culture kefir through submerged and solid state fermentations. The produced microbial biomass was evaluated for single cell protein based applications. In the frame of AIW biorefinery development, the produced microbial biomasses were evaluated as free cells and immobilized on cellulosic residues forming novel biocatalysts for fermented food production. In this thesis a variety of solid and liquid AIW were used: solid forestry (wood sawdust) and brewery (spent grains; BSG) residues, citrus residues (orange pulp), solid wastes of potato starch processing (potato pulp), and cheese whey and molasses, the main liquid wastes of the dairy and sugar industries, respectively. Advantages in maltose fermentation at extremely low temperatures (5–10οC) using an alcohol resistant and cryotolerant yeast strain (S. cerevisiae AXAZ-1) immobilized on porous cellulosic material (or tubular cellulose, TC), produced by delignification of wood sawdust, are reported in the 4th Chapter.Pure maltose and glucose media (80, 100 and 140 g/l) were examined as model substrates to evaluate the potential effect of TC on the rate of fermentation of maltose containing substrates. The use of TC sharply accelerated the rate of maltose fermentation compared to free cells (FC) in suspension. Fermentation at 5οC by immobilized cells was complete, while FC were unable to ferment maltose at this temperature, in contrast to glucose, which was completely fermented. From the results of maltose and glucose fermentations at 5 and 10οC, it was concluded that the effect of TC was higher at lower fermentation temperature and that its promotional effect on fermentation rate had to be at the step of maltose uptake. Specifically, it is suggested that the presence of TC increased maltose uptake rate by the immobilized cells due to attraction by hydrogen bonding on the TC surface and continuous pumping of maltose towards the cells. Calculation of the activation energy of maltose fermentations at 5, 10 and 15οC showed that it was reduced by an average 42% when cells immobilized on TC were used.In the 5th Chapter a novel mixed AIW biorefinery was developed based on S. cerevisiae biomass production. Optimization experiments revealed that submerged cultivation of mixed wastes consisting of orange pulp (aqueous suspension) and molasses at 2:1 ratio, could lead to efficient S. cerevisiae microbial biomass production. Study of temperature and pH effect on biomass production revealed as optimal cultivation conditions the 30οC without pH adjustment. Scale-up experiments had a significant effect on microbial biomass production triplicating the yields. Microbial biomass nutritional value examination revealed that mixed AIW biorefining could lead to a final product rich in fat, protein and minerals.S. cerevisiae cells grown on mixed AIW, free and immobilized on solid AIW were proposed as novel brewery biocatalysts. Batch wort fermentation experiments revealed that the immobilized biocatalysts are potential flavor enhancing brewery biocatalysts. Comparative wort fermentation kinetic analysis revealed that free cells grown on mixed AIW have equivalent fermentation ability with free cells that were produced on glucose synthetic media. Immobilization on orange pulp led to a novel brewery biocatalyst which reduced wort fermentation time by 5-20%. Comparative GC/MS volatile analysis of free and immobilized cells revealed that the orange pulp biocatalyst led to final product with improved taste and aroma by enhancing terpenes and esters formation by 30 and 6 fold, respectively. A second brewery biocatalyst was prepared by immobilization on BSG of yeast grown on AIW leading to reduced fermentation times by 20-30%, while ethanol and residual sugar where at the same levels as in beer fermented with free cells grown on glucose synthetic media. In the frame of multiprocessing biorefinery concept, the biocatalysts after repeated brewing experiments, were used for alternative yeast extract production after cell autolysis. These extracts, in comparison with commercial yeast extracts, presented with efficiency as nutrients during S. cerevisiae cultivation, leading to triplicate productivities. Thus, the proposed yeasts extracts could be successfully used for industrial cell growth nutrients as efficient and cheaper substitutes of commercial yeast extracts. Moreover the addition of the alternative yeast extracts in potato soups was found suitable to substitute commercial flavor enhancing additives such as monosodium glutamate that has been associated with the symptoms of the “Chinese Restaurant Syndrome”.Evaluating these results we proceeded to the development of a novel biorefinery based on S. cerevisiae microbial biomass grown on mixed AIW. The suggested biorefinery could lead to 50.2 g microbial biomass, 2.3 L beer of improved flavor and 8.52 g alternative yeast extract production using an initial feed of 1kg orange pulp and 300 g diluted molasses.In the 6th chapter, substrates consisting of mixed solid and liquid AIW were used for the production of mycelia and mushrooms of A. bisporus. Initially experiments took place for optimizing efficient waste ratio and treatment conditions for A. bisporus mycelium cultivation. Optimization experiments revealed that submerged cultivation of mixed AIW consisting of 59 % potato pulp (aqueous suspension) 6% diluted molasses, 17,5% orange pulp (aqueous suspension) and 17,5% whey, could lead to 0,865 g/gs mycelium production yield. Temperature and pH effect study revealed that the optimal cultivation conditions were 25οC and 5.5, respectively. Scale-up experiments had significant effects on mycelium production and yield, which reached 1,224 g/gs. Nutritional value and GC/MS analysis of volatiled showed that the mycelium produced by submerged fermentation of mixed AIW can be used as potential animal feed due to similar protein and volatiles content as compared with edible mushrooms. Solid state fermentation experiments for A. bisporus growth on various mixed AIW revealed as optimum wastes the BSG and malt spent rootlets (MSR) at a ratio 6:1. The productivity of mushroom fruiting bodies reached 4,2 g per 350 g of mixed solid substrate. The solid substrate due to its high protein content after harvesting of the mushrooms was evaluated through autolysis for the production of alternative yeast extract. Experiments with this extract as S. cerevisiae cultivation nutrient, revealed its high promotional activity increasing yeast growth by 68 % in comparison with commercial yeast extracts. The development of a new generation biorefinery based on singe cell oil production through evaluation of mixed AIW is presented in chapter 7. Initially, mixed liquid wastes were used as potential substrates for the growth of the oleaginous yeast L. starkeyi. Optimization experiments revealed that a substrate of mixed AIW consisting of molasses-orange pulp (aqueous suspension) at 2:1 ratio and treatment at 28οC and pH 5.5 could lead to efficient oleaginous yeast production. Scale-up experiments showed that mixed AIW can be used as potential alternative substrates for oleaginous yeast production due to enhanced yields (0,513 g/gs).Subsequently, tubular cellulose (TC) from lignocellulosic residues was used as immobilization carrier for L. starkeyi. Pure glucose media and liquid mixed AIW were examined as model substrates to evaluate the potential effect of TC on lipid accumulation by the immobilized yeast. TC immobilization increased lipid accumulation and yeast productivity by 44% and 8%, respectively, in glucose media as compared with free cells. Immobilization of the oleaginous yeast on TC increased the unsaturated higher fatty acids (HFA) by 6% and reduced the saturated HFA by 5%. This alteration on the composition of HFAs improves the nutritional value of the produced oil. Evaluating these results, driven by the significant effect of TC in lipid accumulation, a new generation biorefinery is proposed, which concentrates on single cell oil production through evaluation of mixed liquid AIW.A novel biorefinery concept based on kefir microbial biomass production using mixed AIW is also reported in chapter 8. Firstly, mixed liquid wastes were used as potential substrates for kefir biomass production. Optimization experiments revealed that a mixed AIW consisting of 8% molasses, 15% orange pulp (aqueous suspension), 77% whey and treatment 32οC and pH 5.5 could lead to 0,27g/gs kefir production yield. Scale-up experiments doubled the yield revealing that mixed liquid AIW refining could lead to kefir microbial biomass production with high lipid, protein and mineral content.Kefir and S. cerevisiae biomass were also used for the production of a novel two-layer composite biocatalyst of TC covered with starch gel (TC/SG) (with kefir and S. cerevisiae immobilized on TC and SG, respectively). The TC/SG composite biocatalyst was used for mixed AIW valorization for simultaneous production of organic acids and ethanol. Kinetics of organic acid and ethanol formation revealed that TC/SG biocatalyst could lead to high value organic acids production at various concentrations. More specifically, HPLC and GC analysis of fermentation broths demonstrated that mixed AIW bioconversion by TC/SG biocatalyst could lead to production of succinic acid (7.13 g/L), lactic acid (14.21 g/L), citric acid (1.38 g/L) and simultaneous ethanol production (17.36 g/L) at 30οC. The study of the temperature effect on the formation of organic acids revealed the flexibility and capability of TC/SG biocatalyst for various high value chemicals production such as succinic acid in considerable yields. Kinetics for the formation of each organic acid and ethanol are also provided. Evaluating these results, driven by the ability of TC/SG composite biocatalyst to produce organic acids and bioethanol, a new generation biorefinery is reported, using mixed AIW as raw materials.Combining all previous results we propose a novel biorefinery for single cell protein, single cell oil, edible fungi and food additives production through exploitation of mixed AIW. Specifically, the proposed biorefinery can lead to L. starkeyi, S. cerevisiae, kefir and A. bisporus production, novel brewery biocatalysts, protein rich animal feeds, single cell oil, organic acids, ethanol and alternative yeast extracts.

Για την επίτευξη των στόχων της αειφόρου ανάπτυξης, τα βιοδιυλιστήρια παίζουν κυρίαρχο ρόλο καθώς είναι το κλειδί για την πρόσβαση σε μια ολοκληρωμένη φιλική προς το περιβάλλον παραγωγή τροφίμων, ζωοτροφών, χημικών προϊόντων, υλικών και καυσίμων. Η εξεύρεση φθηνών πηγών πρώτης ύλης είναι κομβικής σημασίας καθότι οι περισσότερες βιοδιεργασίες χρησιμοποιούν ως πρώτη ύλη κυρίως γλυκόζη η αύξηση της τιμή της οποίας έχει στρέψει το ερευνητικό ενδιαφέρον στην εξεύρεση εναλλακτικών πρώτων υλών. Ανάμεσα στις προτεινόμενες οικονομικές και αποδοτικές πρώτες ύλες είναι τα αγροτοβιομηχανικά και αστικά απόβλητα.Στο Πρώτο μέρος της διατριβής παρουσιάζονται αναλυτικές πληροφορίες όπως προκύπτουν από την διεθνή και εγχώρια βιβλιογραφία και αφορούν:-Τα βιοδιυλιστήρια και τις πρώτες ύλες και τις διεργασίες αυτών-Τους μικροοργανισμούς που χρησιμοποιούνται-Τα προϊόντα και τα παραπροϊόντα της βιοδιύλισης-Τα αγροτοβιομηχανικά απόβλητα και τα κύρια προϊόντα αξιοποίησης τουςΣτο Δεύτερο μέρος της διατριβής αναφέρονται αναλυτικά οι στόχοι της διδακτορικής διατριβής ενώ στο Tρίτο μέρος γίνεται αναλυτική καταγραφή των μεθόδων και των υλικών που χρησιμοποιήθηκαν για την εκπόνηση του πειραματικού μέρους.Η πρωτοτυπία της διατριβής στηρίζεται στην χρήση μικτών αγροτοβιομηχανικών αποβλήτων για την παραγωγή προϊόντων υψηλής προστιθέμενης αξίας μέσω βιοτεχνολογικών διεργασιών. Πρωταρχικός σκοπός αυτής ήταν η αξιοποίηση των μικτών αποβλήτων για την ανάπτυξη διαφόρων μικροοργανισμών όπως Saccharomyces cerevisiae, Agaricus bisporus, Lipomyces starkeyi και μικτή καλλιέργεια κεφίρ με ζυμώσεις υγρής και στερεής κατάστασης. Κατόπιν η παραγόμενη μικροβιακή βιομάζα αναλύθηκε για την χρήση της ως μονοκυτταρική πρωτεΐνη. Οι παραγόμενες μικροβιακές βιομάζες χρησιμοποιήθηκαν είτε σε ελεύθερη μορφή είτε ακινητοποιημένες σε διάφορα κυτταρινούχα αγροτοβιομηχανικά απόβλητα για την παρασκευή βιοκαταλυτών ώστε να διαμορφωθεί ένα βιοτεχνολογικό βιοδιυλιστήριο μικτών αγροτοβιομηχανικών αποβλήτων. Τα απόβλητα πουχρησιμοποιήθηκαν στη παρούσα διατριβή ήταν στερεά και υγρά αγροτοβιομηχανικά απόβλητα. Ειδικότερα αυτά ήταν κυτταρινούχα στερεά απόβλητα δασοκομείας (πριονίδι) και ζυθοποιίας (spent grains; BSG), η πούλπα των εργοστασίων παραγωγής χυμών εσπεριδοειδών, τα στερεά απόβλητα της μεταποίησης πατάτας, το τυρόγαλα των μονάδων παραγωγής γαλακτοκομικών προϊόντων και η μελάσσα ως υποπροϊόν της βιομηχανίας ζάχαρης.Στο 4ο Κεφάλαιο έγινε μελέτη των κυτταρινούχων αποβλήτων ως φορείς ακινητοποίησης μικροοργανισμών όπου αναδείχθηκε η προωθητική ικανότητα της σωληνωτής κυτταρίνης (πορώδες κυτταρινούχο υλικό που προκύπτει από απολιγνινοποίηση πριονιδιού ξύλου) στην ζύμωση της μαλτόζης σε χαμηλές τιμές θερμοκρασίας. Πιο συγκεκριμένα η συγκριτική μελέτη της ζύμωσης μαλτόζης με ελεύθερα και ακινητοποιημένα κύτταρα του κρυοανθεκτικού και αλκοολανθεκτικού στελέχους S. cerevisiae ΑΧΑΖ-1 σε σωληνωτή κυτταρίνη ανέδειξε ότι το υλικό αυτό επιτάχυνε σημαντικά τον ρυθμό ζύμωσης της μαλτόζης σε χαμηλές τιμές θερμοκρασίας. Έτσι ενώ σε πολύ χαμηλές τιμές θερμοκρασίας (5οC) τα ελεύθερα κύτταρα σακχαρομυκήτων δεν έχουν την ικανότητα να μεταβολίσουν την μαλτόζη, τα ακινητοποιημένα κύτταρα ολοκλήρωσαν την ζύμωση της μαλτόζης σε διάφορες αρχικές συγκεντρώσεις. Η ικανότητα της σωληνωτής κυτταρίνης να προωθεί την δράση του ενζύμου μαλτάση ουσιαστικά μας οδήγησε στην διαμόρφωση ενός προτεινόμενου μηχανισμού δράσης ενώ η ενέργεια ενεργοποίησης της ζύμωσης της μαλτόζης έδειξε ότι μειώνεται κατά 42% όταν χρησιμοποιούνται ακινητοποιημένα κύτταρα. Στο 5ο Κεφάλαιο ακολούθησε η ανάπτυξη ενός βιοδιυλιστηρίου μικτών αγροτοβιομηχανικών αποβλήτων με βάση την παραγωγή μικροβιακής βιομάζας S. cerevisiae. Έγιναν πειράματα βελτιστοποίησης της σύνθεσης των μικτών υγρών αποβλήτων και ακολούθησε μελέτη της επίδρασης της τιμής θερμοκρασίας και της τιμής pH στην αύξηση της απόδοσης της μικροβιακής βιομάζας. Ως βέλτιστη αναλογία υγρών αποβλήτων ανεδείχθη η αναλογία υδατικού διαλύματος πούλπας πορτοκαλιού-μελάσσας 2:1 και ως βέλτιστες συνθήκες ανάπτυξης η τιμή θερμοκρασίας 30οC χωρίς ρύθμιση της τιμής pH. Η αύξηση της κλίμακας της βιοδιύλισης του μικτού υγρού αποβλήτου είχε σημαντική επίδραση στην απόδοση της παραγωγής μικροβιακής βιομάζας τριπλασιάζοντας την απόδοση. Η μελέτη της θρεπτικής αξίας της παραγόμενης μικροβιακής βιομάζας έδειξε ότι η βιοδιύλιση μικτών αγροτοβιομηχανικών αποβλήτων μπορεί να δώσει ένα τελικό προϊόν πλούσιο σε λιπαρά, πρωτεΐνη και μέταλλα. Η παραγόμενη μικροβιακή βιομάζα χρησιμοποιήθηκε είτε σε ελεύθερη μορφή είτε ακινητοποιημένη σε στερεά αγροτοβιομηχανικά απόβλητα για την παραγωγή βιοκαταλυτών κατάλληλων για ζυμώσεις ζυθογλεύκους. Παρήχθησαν δύο διαφορετικοί βιοκαταλύτες (κύτταρα ακινητοποιημένα σε πούλπα πορτοκαλιού ή BSG) οι οποίοι είχαν ισότιμη ζυθοποιητική ικανότητα με τα ελεύθερα κύτταρα αλλά απέδωσαν ένα τελικό προϊόν με καλύτερα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά. Αρχικά έγινε συγκριτική μελέτη των κινητικών ζύμωσης ζυθογλεύκους με ελεύθερα κύτταρα που παρήχθησαν με μικτά αγροτοβιομηχανικά απόβλητα και με ελεύθερα κύτταρα που παρήχθησαν σε συνθετικά θρεπτικά μέσα και ανεδείχθη η ισότιμη ζυθοποιητική τους ικανότητα. Ο πρώτος ζυθοποιητικός βιοκαταλύτης που παρασκευάστηκε με ακινητοποίηση S. cerevisiae σε πούλπα πορτοκαλιού μείωσε τον χρόνο ζύμωσης κατά 5-20% ενώ η παραγόμενη μπύρα είχε 30 φορές περισσότερα τερπένια και 6 φορές περισσότερους εστέρες δίνοντας ένα αρωματικότερο τελικό προϊόν. Ο δεύτερος ζυθοποιητικός βιοκαταλύτης παρασκευάστηκε με ακινητοποίηση S. cerevisiae σε BSG μείωσε τον χρόνο ζύμωσης κατά 20-30% με την περιεκτικότητα σε αιθανόλη και σε αζύμωτο σάκχαρο να είναι στα ίδια επίπεδα με μπύρες που παρασκευάστηκαν με ελεύθερα κύτταρα. Οι ζυθοποιητικοί βιοκαταλύτες μετά από επαναλαμβανόμενες ζυμώσεις ζυθογλεύκους παρελήφθησαν και αυτολύθηκαν με σκοπό την παρασκευή εναλλακτικών εκχυλισμάτων μικροβιολογίας. Τα εναλλακτικά εκχυλίσματα μικροβιολογίας μελετήθηκαν συγκριτικά με τα εμπορικά εκχυλίσματα μικροβιολογίας ως προς την απόδοση τους στην ανάπτυξη του μικροοργανισμού S. cerevisiae. Η συγκριτική μελέτη ανάπτυξης έδειξε ότι τα εναλλακτικά εκχυλίσματα μπορούν να τριπλασιάσουν την απόδοση στην παραγωγή μικροοργανισμού. Επίσης η χρήση των εναλλακτικών εκχυλισμάτων μικροβιολογίας ως ενισχυτικά γεύσης σε σούπες πατάτας έδειξε ότι μπορούν να χρησιμοποιηθούν προκειμένου να αντικαταστήσουν το γλουταμινικό μονονάτριο που έχει κατηγορηθεί για την πρόκληση του λεγόμενου «συνδρόμου του κινέζικου εστιατορίου».Με βάση την μικροβιακή βιομάζα που αναπτύχθηκε σε μικτά αγροτοβιομηχανικά απόβλητα καθώς και των προϊόντων που παρήχθησαν με την χρήση της μικροβιακής βιομάζας ακολούθησε ο σχεδιασμός ενός πρωτότυπου βιοδιυλιστηρίου. Το προτεινόμενο βιοδιυλιστήριο μπορεί με 1 kg πούλπας πορτοκαλιού και 300 g αραιωμένης μελάσσας να δώσει 50,2 γραμμάρια μικροβιακής βιομάζας S. cerevisiae, 2,3 L μπύρας καλής ποιότητας και 8,52 g εναλλακτικού εκχυλίσματος μικροβιολογίας.Στο 6ο Κεφάλαιο τα μικτά στερεά και υγρά αγροτοβιομηχανικά απόβλητα αποτέλεσαν πρώτη ύλη και για την παραγωγή καρποσωμάτων και μικκυλίων του εδώδιμου μύκητα A. bisporus. Αρχικά σε διάφορα μίγματα υγρών αγροτοβιομηχανικών αποβλήτων έγινε εμβολιασμός του μύκητα ώστε να ευρεθεί η βέλτιστη αναλογία αποβλήτων για την παραγωγή μικκυλίων ενώ ακολούθησαν πειράματα μελέτης της επίδρασης της τιμής θερμοκρασίας και της τιμής pH. Ως ιδανικότερο υπόστρωμα στην ανάπτυξη μικκυλίων ανεδείχθη το υπόστρωμα με σύσταση: 59% υδατικό διάλυμα πούλπας πατάτας, 6% αραιωμένη μελάσσα, 17,5 % υδατικό διάλυμα πούλπας πορτοκαλιού και 17,5 % τυρόγαλο με την απόδοση να φτάνει στα 0,865 g ανά g σακχάρου (g/gs) σε τιμή θερμοκρασίας 25οC και τιμή pH 5,5. Η αύξηση της κλίμακας της βιοδιύλισης του μικτού υγρού αποβλήτου είχε σημαντική επίδραση στην απόδοση της παραγωγής μικκυλίου με την απόδοση να φτάνει στα 1,224 g/gs.Η ανάλυση της θρεπτικής αξίας των μικκυλίων του A. bisporus έδειξε ότι μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως ζωοτροφή καθώς τα ποσοστά πρωτεΐνης είναι στα ίδια επίπεδα με εδώδιμα μανιτάρια που αναπτύσσονται σε στερεά υποστρώματα (31%). Η ανάλυση με GC/MS των πτητικών προϊόντων του μικκυλίου έδειξε ότι είναι στα ίδια επίπεδα με εμπορικά μανιτάρια.Η μελέτη της ζύμωσης στερεάς κατάστασης του μύκητα A. bisporus σε στερεά μίγματα αγροτοβιομηχανικών αποβλήτων που αποτελούνταν από πούλπα πορτοκαλιού BSG και ΜSR έδειξε ως βέλτιστη αναλογία αυτή των BSG-MSR 6:1 δίνοντας 4,2 g καρποσωμάτων ανά 350 g υποστρώματος. Ωστόσο το υπόστρωμα ανάπτυξης του μύκητα ήταν πλούσιο σε πρωτεΐνη και από αυτό παρήχθη εναλλακτικό εκχύλισμα μικροβιολογίας με αυτόλυση το οποίο συγκριτικά με το εμπορικό εκχύλισμα μικροβιολογίας αύξησε την παραγωγή S. cerevisiae κατά 68%.Στο 7ο Κεφάλαιο της διατριβής έγιναν πειράματα προκειμένου να αναπτυχθεί ένα βιοδιυλιστήριο παραγωγής μικροβιακού λίπους από μικτά αγροτοβιομηχανικά απόβλητα. Αρχικά έγινε μελέτη της ανάπτυξης του ελαιογενή μικροοργανισμού L. starkeyi σε μικτά υγρά αγροτοβιομηχανικά απόβλητα καθώς και εύρεση των βέλτιστων συνθηκών ανάπτυξης. Ως βέλτιστο υπόστρωμα ανάπτυξης ανεδείχθη το υπόστρωμα με αναλογία μελάσσα-υδατικού διαλύματος πούλπας πορτοκαλιού 2:1 και ιδανικότερες συνθήκες η τιμή θερμοκρασίας 28οC και τιμή pH 5,5. Η απόδοση σε μεγαλύτερη κλίμακα έφτασε στα 0,513 g/gs αποδεικνύοντας ότι τα μικτά αγροτοβιομηχανικά απόβλητα μπορούν να αξιοποιηθούν για την παραγωγή ελαιογενών ζυμών.Τα λιγνοκυτταρινούχα απόβλητα χρησιμοποιήθηκαν και ως φορείς ακινητοποίησης ελαιογενών ζυμών. Πιο συγκεκριμένα κύτταρα της ελαιογενούς ζύμης L. starkeyi ακινητοποιήθηκαν σε σωληνωτή κυτταρίνη και μελετήθηκε η επίδραση της ακινητοποίησης στην συσσώρευση μικροβιακού λίπους με ζύμωση τόσο συνθετικών θρεπτικών μέσων γλυκόζης όσο και μικτών αγροτοβιομηχανικών αποβλήτων. Η χρήση ακινητοποιημένης ελαιογενούς ζύμης στην ζύμωση συνθετικού θρεπτικού μέσου αύξησε κατά 44% την συσσώρευση μικροβιακού λίπους και 8% την παραγωγικότητα βιομάζας σε σχέση με τα ελεύθερα κύτταρα. Η αεριοχρωματογραφική ανάλυση των μεθυλεστέρων των λιπαρών οξέων του παραγόμενου μικροβιακού λίπους έδειξε ότι η ακινητοποίηση ενίσχυσε κατά 6% τον σχηματισμό ακόρεστων λιπαρών οξέων και μείωσε κατά 5% τα κορεσμένα λιπαρά οξέα ενισχύοντας έτσι την θρεπτική αξία του παραγόμενου λίπους.Αξιολογώντας τα πειραματικά αποτελέσματα του Κεφαλαίου 7 σχεδιάστηκε και αναπτύχθηκε ένα βιοδιυλιστήριο ανάπτυξης ελαιογενούς ζύμης και παραγωγής μικροβιακού λίπους και βιοντίζελ από κύτταρα ελαιογενούς ζύμης που ακινητοποιήθηκαν σε σωληνωτή κυτταρίνη.Στο 8ο Κεφάλαιο της διατριβής παρουσιάζονται τα πειράματα που έγιναν προκειμένου να αναπτυχθεί ένα βιοδιυλιστήριο παραγωγής μικτής καλλιέργειας κεφίρ από μικτά αγροτοβιομηχανικά απόβλητα. Έγιναν πειράματα βελτιστοποίησης της αναλογίας των υγρών αποβλήτων και ακολούθησε μελέτη της επίδρασης της τιμής θερμοκρασίας και της τιμής pH στην αύξηση της απόδοσης της παραγωγής μικροβιακής βιομάζας κεφίρ. Ωςβέλτιστο ανεδείχθη το μικτό απόβλητο που αποτελούνταν από 77% τυρόγαλο, 15% υδατικό διάλυμα πούλπας πορτοκαλιού 8% αραιωμένη μελάσσα και ως βέλτιστες συνθήκες ανάπτυξης η τιμή θερμοκρασίας των 32οC και τιμή pH 5,5 με την απόδοση βιομάζας να φτάνει 0,27 g/gs. Η αύξηση της κλίμακας της βιοδιύλισης του μικτού υγρού αποβλήτου είχε σημαντική επίδραση στην απόδοση της παραγωγής μικροβιακής βιομάζας διπλασιάζοντας την απόδοση. Η μελέτη της θρεπτικής αξίας της παραγόμενης μικροβιακής βιομάζας κεφίρ έδειξε ότι η βιοδιύλιση μικτών αγροτοβιομηχανικών αποβλήτων μπορεί να δώσει ένα τελικό προϊόν πλούσιο σε λιπαρά, πρωτεΐνη και μέταλλα.Η παραγόμενη μικροβιακή βιομάζα κεφίρ και μικροβιακή βιομάζα S. cerevisiae χρησιμοποιήθηκαν για την παρασκευή ενός βιοκαταλύτη διπλής στοιβάδας σωληνωτής κυτταρίνης/γέλης αμύλου. Ο παραγόμενος βιοκαταλύτης χρησιμοποιήθηκε για την βιοδιύλιση μικτού αποβλήτου αραιωμένης μελάσσας-τυρογάλακτος. Οι κινητικές σχηματισμού οργανικών οξέων και αιθανόλης ανέδειξαν την ικανότητα του βιοκαταλύτη να παράγει μια ποικιλία οργανικών οξέων σε διάφορες συγκεντρώσεις ανάλογα με την τιμή θερμοκρασίας ζύμωσης. Πιο συγκεκριμένα η βιοδιύλιση του μικτού αποβλήτου αραιωμένης μελάσσας και τυρογάλακτος μπορεί να δώσει 6,47 g/L ηλεκτρικό οξύ, 15,1 g/L γαλακτικό οξύ, 1,22 g/L κιτρικό οξύ και 17,36 g/L αιθανόλη. Η ικανότητα του κεφίρ και του S. cerevisiae να αναπτύσσεται σε μικτά αγροτοβιομηχανικά αλλά και η ικανότητα του βιοκαταλύτη διπλής στιβάδας να παράγει μια μεγάλη ποικιλία οργανικών οξέων και αιθανόλης με βιοδιύλιση μικτού αποβλήτου μας οδήγησε στον σχεδιασμό βιοδιυλιστηρίου μικτών αποβλήτων.Συνολικά το προτεινόμενο βιοδιυλιστήριο μικτών αγροτοβιομηχανικών αποβλήτων έχει την ικανότητα να παράγει μια πληθώρα προϊόντων προστιθέμενης αξίας. Έχει την ικανότητα να παράγει μικροβιακή βιομάζα διαφόρων μικροοργανισμών όπως L. starkeyi, S. cerevisiae, κεφίρ, μικκύλια και καρποσώματα του μύκητα A. bisporus, ζυμωτικούς βιοκαταλύτες ικανούς να παράγουν μπύρα με ανώτερα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά, μικροβιακό λίπος, οργανικά οξέα, αιθανόλη, εναλλακτικά εκχυλίσματα μικροβιολογίας και ζωοτροφή.