Development of holistic analytical methods for disease biomarker discovery and the study of drug efficasy in autoimmune disease

Abstract

Autoimmunity characterises a biological state within which the immune system fails to recognise the host leading to a cascade of self attacks. Rheumatoind Arthritis has been often regarded as a prototype autoimmune disease due to clear role of autoimmunity in disease manifestation. Clinical indications of RA are symmetrical polyarthritis and joint swelling that progressively causes bone erosion and cartilage destruction leaving patients in severe pain and disability. Currently RA diagnostic tools employ radiographic imaging and clinical examinations of immunological markers such as RF and ACPA, fail to provide adequate diagnostic power at early disease onset with inevitable consequences to patients life quality. On this PhD project metabolic profile technologies are employed to study RA biology in the hunt of metabolites with clear association to disease manifestation. Global and targeted LC-MS based metabolite approaches were applied for the analysis of urine, serum, hind limb joint and synovial fibroblasts extracts. All samples were collected from in vivo model TG197 that closely mimics the human TNFa RA expression that could potentially help the translation of the finding into the clinic. For this purpose a targeted LC-MS based analytical platform was successfully developed and validated using an ion pair chromatographic separation that enabled detection of more than a hundred polar metabolic intermediates involved in key metabolic pathways. Dried biofluid spot technology was also investigated as alternative to liquid biofluid storage. Short term stability (24hours) study revealed close proximity of the metabolic phenotype of the DBS samples and those of the protein precipitated samples. However medium (1 week) to long (1 month) term stability at room temperature was found poor but card storage at -20ºC or below can improve stability. Global urine metabolic analysis revealed clear differentiation between TG and WT phenotype across all weeks starting from 6 up to 11 weeks of mouse age. Remicade treatment of TG animals found beneficial in progressive swift of the metabolic phenotype from TG to WT like one. Strong evidence of phenotypic differentiation with steroid related marker was found. On the other hand targeted metabolic analysis identified itaconic acid as a proximal marker to RA expression. Serum global metabolite analysis were also shown clear differentiation between TG and WT phenotype. Targeted metabolic profile provided more easily interpreted data with major metabolic differences corresponding to aminoacids and central carbon metabolism. Similarly to urine, itaconic acid revealed strong correlation with disease expression and with potential of non-invasive marker monitoring capability. On line lithium adduct formation combined with ion mobility separation was investigated and unravelled its potential in enhancing lipid fragmentation data associated with differentiating lipid species between TG and WT organic hind limb extracts. Metabolic changes associated primarily with energy producing metabolic pathways (glycolysis, starch metabolism) were found following targeted analysis of aqueous hind limb extracts. To our best of knowledge this is the first time that LC-MS metabolic profiling approaches was implemented to RA biology on the TG197 in vivo model and its responses to standard of care anti-TNFa (Remicade) treatment.

Ως αυτοάνοσα νοσήματα χαρακτηρίζονται παθοφυσιολογικές καταστάσεις στις οποίες το ανοσοποιητικό σύστημα ενός οργανισμού στρέφεται εναντίων του ιδίου του οργανισμού. Μέχρι σήμερα έχουν αναγνωριστεί πάνω από 100 αυτοάνοσες παθήσεις με την ρευματοειδή αρθρίτιδα (ΡΑ) να θεωρείται πρότυπο αυτοάνοσο νόσημα εξαιτίας της ξεκάθαρης συμμετοχής του ανοσοποιητικού συστήματος στην εκδήλωση της ασθένειας. Η ΡΑ εκδηλώνεται με πρήξιμο των αρθρώσεων, ανάπτυξη συμμετρικής πολυαρθρίτιδας που προοδευτικά οδηγεί στην καταστροφή του χόνδρου και της οστικής μάζας της άρθρωσης τα όποια προκαλούν σημαντικά προβλήματα κινητικότητας στους ασθενείς. Η διάγνωση της ΡΑ στηρίζεται στη ραδιογραφική απεικόνιση της άρθρωσης σε συνδυασμό με κλινική διερεύνηση για την ύπαρξη κλινικών δεικτών όπως ο ρευματοειδής παράγοντας (RF) και αντισώματα ACPA. Με τα παραπάνω εργαλεία είναι δύσκολη η διάγνωση της ΡΑ σε πρώιμο στάδιο.Στα πλαίσια αυτής της διδακτορικής διατριβής χρησιμοποιήθηκαν τεχνικές στοχευμένης και ολιστικής ανάλυσης μεταβολιτών σε δείγματα ούρων, ορού αίματος και εκχυλισμάτων αρθριτικής άρθρωσης τα οποία συλλέχθηκαν από το πειραματικό μοντέλο ΤG197 ποντικίων με στόχο την ανεύρεση μεταβολιτών που σχετίζονται με την έκφραση της ΡΑ. Αναπτύχθηκε αναλυτική μεθοδολογία (LC-MS) που επέτρεψε την στοχευμένη ανάλυση περισσοτέρων από 100 μεταβολιτών οι οποίοι μετέχουν σε μεταβολικά μονοπάτια όπως η γλυκολιτική οδός, ο κύκλος του κιτρικού οξέος, ο μεταβολισμός νουκλεοτιδίων κ.α. Διερευνήθηκε επίσης η τεχνολογία απόθεσης κηλίδας βιολογικών δειγμάτων προερχόμενων από αίμα και ούρα. Η μελέτη σταθερότητας της παραπάνω τεχνολογίας σε σχέση με την υγρή αποθήκευση δείγματος έδειξε ότι το μεταβολικό προφίλ δεν μεταβάλλεται σημαντικά εντός 24 ωρών αλλά για μεγαλύτερο διάστημα αποθήκευσης ακόμη και σε θερμοκρασίες χαμηλότερες των -20°C το μεταβολικό προφίλ διαφοροποιείται σηματικά από αυτό των δειγμάτων αναφοράς. Η ολιστική ανάλυση δειγμάτων ούρων έδειξε σημαντική διαφοροποίηση μεταξύ του μεταβολικού προφίλ ασθενών και υγιών ποντικών μεταξύ της 6ης και 11ης εβδομάδος της ηλικίας τους. Η χορήγηση φαρμάκου Remicade μετατόπισε το μεταβολικό προφίλ των δειγμάτων ούρων από αυτό των άρρωστων σε αυτό των υγιών ποντικών μέτά από 3 εβδομάδες θεραπείας. Στεροείδης ενώσεις βρέθηκαν να συμμετέχουν στη διαφοροποίηση του μεταβολικού προφίλ των ομάδων δειγμάτων ούρων ενώ το ιτακονικό όξυ βρέθηκε να σχετίζεται με την έκφραση της ΡΑ μετά από στοχευμένη ανάλυση δειγμάτων ούρων. Ανάλογη διαφοροποίηση του μεταβολικού προφίλ μεταξύ υγιών και ασθενών ποντικών παρατηρήθηκε και στα δείγματα ορού αίματος τόσο στην εβδομάδα 6 όσο και στην εβδομάδα 11 της ηλικίας των ποντικών. Στοχευμένη ανάλυση σε δείγματα ορού αίματος έδειξε αλλαγή των ενδογενών συγκεντρώσεων μεταβολιτών σχετικών με το μεταβολισμό αμινοξέων και του κεντρικού μεταβολισμού άνθρακα. Το ιτακονικό οξύ παρουσίασε ανάλογη μεταβολή με αυτή στα δείγματα ούρων. Προσθήκη ιόντων λιθίου βοήθησε στη καλύτερη θραύση ιόντων λιπιδίων ένω η χρήση της τεχνολογίας κινητικότητος ιόντων βελτίωσε τη χρωματογραφική ικανότητα διαχωρισμού λιπιδίων σε οργανικά εκχυλίσματα αρθριτικής άρθρωσης. Στοχευμένη ανάλυση υδατικών δειγμάτων εκχύλισης της αρθριτικής άρθρωσης ανέδειξε αλλαγές μεταβολιτών σχετιζόμενων με το μηχανισμό την παραγωγή ενέργειας. Από όσο γνωρίζω αύτη είναι η πρώτη φόρα που τεχνολογία στοχευμένης και ολιστικής ανάλυσης μεταβολιτών χρησιμοποιείται στη μελέτη της βιολογίας της ΡΑ όπως αύτη εκφράζεται μέσω το πειραματικού μοντέλου TG197 αλλά και στη μελέτη της απόκρισης του μοντέλου αυτού στην θεραπεία με φάρμακο Remicade.