Παραλλακτικότητα του γονιδίου DRB1 σε ελληνικές φυλές προβάτων και συσχετισμός των αλληλομορφών του με παρασιτολογικές και παραγωγικές παραμέτρους

Abstract

The Major Histocompatibility Complex (MHC) is a gene cluster withfunctional role, mainly concerning immunological properties. The DRB1 gene, themost polymorphic gene of the MHC, encodes the beta chain of the MHC class IImolecule and is located on the surface of antigen-presenting cells (APC). APCspresent antigen peptide fragments to CD4+ T-lymphocytes, deriving fromextracellular proteins and parasites, complexed with MHC class II molecules on theirsurfaces. The intense DRB1 gene polymorphism is localized primarily in exon 2,which encodes a portion of the peptide binding region (PBR) of MHC class IImolecules and therefore, the variability of exon 2 is directly related to the organism’simmune response.So far no studies have investigated the variability of the sheep’s gene DRB1(Ovar-DRB1) in Greek breeds. In the international Immuno-Polymorphism Databasefor Ovar-MHC (IPD-MHC Database EMBL-EBI), are currently registered 88different nucleotide sequences of exon 2 of the Ovar-DRB1 gene from foreign sheepbreeds used mainly for wool and meat production. Moreover, in literature there arepublished studies in which Ovar-DRB1 alleles are associated with resistance,particularly to nematodes, as well as with various other properties concerningproduction traits in sheep. The purpose of this study was to investigate the presence ofOvar-DRB1 alleles in two Greek sheep breeds and their association with resistance togastrointestinal parasitosis, as well as with dairy characteristics.Blood and fecal samples were collected from two flocks with 232 sheep of theFrizarta breed and with 203 of the Kalarrytiko breed, while performance data havebeen collected regarding both flocks. Genomic DNA has been isolated from eachblood sample in order to amplify exon 2 of the Ovar-DRB1 gene, using TouchdownPCR, to avoid the formation of non specific products. Direct sequencing of theamplified products was conducted afterwards for the identification of the alleles. Thesequence of exon 2 of the new alleles was verified by a second PCR, in which adifferent pair of primers was used and subsequently cloning of the products wasconducted before sequencing. The products of the second PCR were integrated intothe plasmid vector pBlueScript SK, which was used for the transformation ofcompetent E. coli bacteria of the strain JM109, in culture. The new alleles weredetected in the transformed bacterial colonies using the Colony PCR, whose productswere digested with the restriction enzyme RsaI. From these colonies plasmid vectorswere isolated and sequencing of their inserts was conducted, confirming the sequenceof exon 2 of the new alleles.Evaluation of parasitological parameters was effected through faecal countingof the reproductive elements of the gastrointestinal parasites (Faecal Egg Counting, FEC) and through determination of the levels of pepsinogen by the modifiedHirschowitz method in blood plasma.According to the results, a total of 39 Ovar-DRB1 alleles were identified, 10of which are reported for the first time in literature, while 134 different genotypeswere counted. A high heterozygosity rate was recorded, 84.49%, which is considerednormal for the Ovar-DRB1 gene. Only 15 out of 134 genotypes were common in bothbreeds, while new alleles were identified in 54% of the genotypes of Kalarrytiko andin 23% of the genotypes of Frizarta sheep. In Kalarrytiko breed a significant deficit ofheterozygous genotypes was observed.The largest percentage of animals with a high parasitic load and highpepsinogen levels in plasma was detected in the Kalarrytiko breed. Although in bothbreeds coccidia oocysts (Eimeria spp) and strongyles were found, cestode Monieziaexpansa and nematode Nematodirus filicollis eggs were detected only in Kalarrytiko,while nematode Capillaria spp eggs were found only in Frizarta sheep. Also, in22.6% of Kalarrytiko sheep more than one type of reproduction elements were foundin the same animal, in contrast to 1.6% of Frizarta sheep.In Kalarrytiko breed, the G group alleles were significantly associated withlow FEC values, while K group alleles showed weak correlation with high FECvalues. We also observed a weak correlation of I group alleles with low mI.U.tyrosine values. In Frizarta breed, K group alleles were significantly associated withlow mI.U. tyrosine values. Also, the K group alleles had a significant effect on thepercentage of total solids concentration, the protein content, the fat content and thelactose concentration, while the E group alleles had a significant effect on the lactoseconcentration. The impact of the K group alleles was significant. In Kalarrytiko breed,they had an effect on the FEC values, while in Frizarta breed they had an effect on themI.U. tyrosine values and milk constituents.Infestation of gastrointestinal parasites did not affect significantly the milkproduction characteristics of the Frizarta breed ewes, while in Kalarrytiko breed ewesthey were significantly associated with low protein content and low solids-not-fatlevels, but also with increased milk production (overcompensation), indicating theextremely high tolerance and adaptability of the breed.

Το Μείζον Σύστημα Ιστοσυμβατότητας (MHC) είναι ένα σύμπλοκο γονιδίωνμε λειτουργικό ρόλο που, κυρίως, αφορά ανοσολογικές ιδιότητες. Το γονίδιο DRB1,το πιο πολυμορφικό γονίδιο του MHC, κωδικοποιεί τη β πολυπεπτιδική αλυσίδα τουμορίου MHC της τάξεως ΙΙ και εδράζεται στην επιφάνεια τωναντιγονοπαρουσιαστικών κυττάρων (APC). Τα APC παρουσιάζουν στα CD4+ T-λεμφοκύτταρα πεπτιδικά τμήματα αντιγόνων, προερχόμενα από εξωκυτταρικέςπρωτεΐνες και παράσιτα, μέσω των μορίων MHC της τάξεως ΙΙ που διαθέτουν. Οέντονος πολυμορφισμός του γονιδίου DRB1 εντοπίζεται κατά κύριο λόγο στο εξόνιο2, το οποίο κωδικοποιεί τμήμα της περιοχής δέσμευσης του αντιγονικού πεπτιδίου(PBR) των μορίων MHC της τάξεως ΙΙ και ως εκ τούτου η παραλλακτικότητα τουεξονίου 2 σχετίζεται άμεσα με την ανοσολογική απόκριση του οργανισμού.Έως τώρα δεν έχει μελετηθεί η παραλλακτικότητα του γονιδίου του προβάτουDRB1 (Ovar-DRB1) σε ελληνικές φυλές. Στη διεθνή Βάση ΔεδομένωνΑνοσοπολυμορφισμού για το Ovar-MHC (IPD-MHC Database EMBL-EBI),βρίσκονται καταχωρημένες 88 διαφορετικές νουκλεοτιδικές αλληλουχίες του εξονίου2 του γονιδίου Ovar-DRB1 προβάτων από ξένες φυλές, κυρίως, εριοπαραγωγικής καικρεοπαραγωγικής κατεύθυνσης. Επιπλέον, στη βιβλιογραφία υπάρχουνδημοσιευμένες εργασίες στις οποίες αλληλόμορφα του γονιδίου Ovar-DRB1σχετίζονται με την ανθεκτικότητα, κυρίως, σε νημάτωδα, καθώς και με διάφορεςάλλες ιδιότητες που αφορούν σε παραγωγικά χαρακτηριστικά του προβάτου. Σκοπόςτης παρούσας εργασίας ήταν η μελέτη της παρουσίας αλληλομόρφων Ovar-DRB1 σεδύο ελληνικές φυλές προβάτων και ο συσχετισμός τους με την ανθεκτικότητα σεγαστρεντερικές παρασιτώσεις, καθώς και με χαρακτηριστικά της γαλακτοπαραγωγήςτους.Συλλέχτηκαν δείγματα αίματος και κοπράνων από δύο ποίμνια αποτελούμενααπό 232 πρόβατα Φριζάρτας και 203 Καλαρρύτικα, αντίστοιχα, ενώ λήφθηκαν καιστοιχεία από τον έλεγχο των αποδόσεων των δύο ποιμνίων. Από κάθε δείγμα αίματοςαπομονώθηκε το γονιδιωματικό DNA για την ενίσχυση του εξονίου 2 του γονιδίουOvar-DRB1, η οποία διεξήχθη με Touchdown PCR, ώστε να αποφευχθεί οσχηματισμός μη ειδικών προϊόντων. Ακολούθησε η απευθείας αλληλούχηση τωνενισχυμένων προϊόντων για την ταυτοποίηση των αλληλομόρφων. Η αλληλουχία τουεξονίου 2 των νέων αλληλομόρφων επαληθεύτηκε με δεύτερη PCR, στην οποίαχρησιμοποιήθηκε διαφορετικό ζεύγος εκκινητών και εν συνεχεία διενεργήθηκεκλωνοποίηση των προϊόντων της πριν την αλληλούχηση. Τα προϊόντα της δεύτερηςPCR ενσωματώθηκαν στον πλασμιδιακό φορέα pBlueScript SK, ο οποίοςχρησιμοποιήθηκε για τον μετασχηματισμό των επιδεκτικών βακτηρίων E. coli του στελέχους JM109, σε καλλιέργεια. Tα νέα αλληλόμορφα εντοπίστηκαν στιςμετασχηματισμένες βακτηριακές αποικίες με τη βοήθεια της διεξαγωγής της ColonyPCR, τα προϊόντα της οποίας υπέστησαν πέψη με το ένζυμο περιορισμού RsaI. Απότις αποικίες αυτές απομονώθηκαν οι πλασμιδιακοί φορείς στους οποίους διεξήχθη ηαλληλούχηση του ενθέματός τους, επιβεβαιώνοντας την αλληλουχία του εξονίου 2των νέων αλληλομόρφων.Ο έλεγχος των παρασιτολογικών παραμέτρων διενεργήθηκε με τηνκοπρανολογική καταμέτρηση των αναπαραγωγικών στοιχείων των γαστρεντερικώνπαρασίτων (Faecal Egg Counting, FEC) και με τον προσδιορισμό των επιπέδων τουπεψινογόνου με την τροποποιημένη μέθοδο Hirschowitz στο πλάσμα του αίματος.Σύμφωνα με τα αποτελέσματα, ταυτοποιήθηκαν συνολικά 39 αλληλόμορφαOvar-DRB1, εκ των οποίων 10 αναφέρονται για πρώτη φορά στη βιβλιογραφία, ενώκαταμετρήθηκαν 134 διαφορετικοί γονότυποι. Καταγράφηκε υψηλό ποσοστόετεροζυγωτίας, 84,49%, γεγονός το οποίο θεωρείται φυσιολογικό για το γονίδιοOvar-DRB1. Μόνον 15 στους 134 γονότυπους ήταν κοινοί και στις δύο φυλές, ενώστο 54% των γονότυπων των Καλαρρύτικων και στο 23% των γονότυπων τωνπροβάτων Φριζάρτας ταυτοποιήθηκαν νέα αλληλόμορφα. Στην Καλαρρύτικη φυλήπαρατηρήθηκε σημαντικό έλλειμμα ετεροζυγωτών γονότυπων.Το μεγαλύτερο ποσοστό ζώων με υψηλό παρασιτικό φορτίο και με υψηλάεπίπεδα πεψινογόνου στο πλάσμα εντοπίστηκε στην Καλαρρύτικη φυλή. Αν και στιςδύο φυλές βρέθηκαν ωοκύστες κοκκιδίων (Eimeria spp) και στρογγυλοειδή αυγάνηματωδών (strongyles), αυγά του κεστώδους Moniezia expansa και του νηματώδουςNematodirus filicollis ανιχνεύθηκαν μόνο στα Καλαρρύτικα, ενώ μόνο στα πρόβαταΦριζάρτας βρέθηκαν αυγά του νηματώδους Capillaria spp. Επίσης, στο 22,6% τωνΚαλαρρύτικων προβάτων βρέθηκαν περισσότερα του ενός είδους αναπαραγωγικάστοιχεία στο ίδιο ζώο, σε αντίθεση με το 1,6% των προβάτων Φριζάρτας.Στην Καλαρρύτικη φυλή, τα αλληλόμορφα της ομάδας G σχετίζοντανσημαντικά με χαμηλές τιμές FEC, ενώ της ομάδας Κ εμφάνισαν ασθενή συσχέτιση μευψηλές τιμές FEC. Επίσης, παρατηρήθηκε ασθενή συσχέτιση των αλληλομόρφων τηςομάδας Ι με χαμηλές τιμές mI.U. τυροσίνης. Στη φυλή Φριζάρτας, τα αλληλόμορφατης ομάδας Κ σχετίζονταν σημαντικά με χαμηλές τιμές mI.U. τυροσίνης. Επίσης, τααλληλόμορφα της ομάδας Κ είχαν σημαντική επίδραση στην ποσοστιαίασυγκέντρωση των ολικών στερεών, στην πρωτεϊνοπεριεκτικότητα, στηλιποπεριεκτικότητα και στη συγκέντρωση λακτόζης, ενώ τα αλληλόμορφα τηςομάδας Ε επιδρούσαν σημαντικά στη συγκέντρωση της λακτόζης. Η επίδραση τωναλληλομόρφων της ομάδας Κ ήταν σημαντική. Στην Καλαρρύτικη φυλή επιδρούσανστις τιμές FEC, ενώ στη φυλή Φριζάρτας στις τιμές mI.U. τυροσίνης και σεσυστατικά του γάλακτος.Η προσβολή από γαστρεντερικά παράσιτα δεν επέδρασε σημαντικά σταγαλακτοπαραγωγικά χαρακτηριστικά των προβατίνων της φυλής Φριζάρτας, ενώ στιςπροβατίνες της Καλαρρύτικης φυλής σχετιζόταν σημαντικά με χαμηλήπρωτεϊνοπεριεκτικότητα και με χαμηλά επίπεδα στερεού υπολείμματος άνευ λίπους,αλλά και με αυξημένη γαλακτοπαραγωγή (υπεραντιστάθμιση), υποδηλώνοντας τηνεξαιρετικά μεγάλη ανθεκτικότητα και προσαρμοστικότητα της φυλής.