Ανάπτυξη αναλυτικών μεθόδων με βάση τη φασματοσκοπία NMR για την ανίχνευση νοθείας ραφιναρισμένου ελαιολάδου με ραφιναρισμένο φουντουκέλαιο, τον ποσοτικό προσδιορισμό CIS-TRANS λιπαρών οξέων σε λίπη και έλαια και συστατικών της ρίγανης με φαρμακολογικές ιδιότητες

Abstract

The present study refers to the development of analytical methods, based on nmr spectroscopy, for the detection of refined olive oil adulteration with refined hazelnut oil, the quantitative determination of cis and trans components in lipids and oil by 1h nmr spectroscopy at low magnetic fields, and the determination of phenolic compounds and triterpenic acids in oregano growingwild in greece by employing 31P NMR spectroscopy. The first analytical method was based on the phosphitylation of hydroxyl groups of phenolic compounds and triterpenic acids present in oregano with the appropriate phosphorus reagent and the subsequent detection of the phosphitylatedcompounds by employing 31P NMR spectroscopy. The analysis was based on spectral parameters of model compounds, determined in the present study. 1D (1 H, 31P) and 2D (1 H,1 H-gCOSY, 31P,1H-HMQC) NMR spectroscopy was utilised for the assignment of model compounds with more than one hydroxyl groups. The present methodology was able to detect and determine quantitatively thetriterpenic acids oleanolilc and ursolic as well as the following phenolic compounds: benzyl alcohol, borneol, carvacrol, thymol, ferulic acid, rosmarinic acid, chlorogenic acid, apigenin, naringenin, taxifolin, eriodictyol and cis-3- hexen-1-ol. In the second analytical method, NMR spectroscopy was employed for the detection of adulteration of refined olive oil with refined hazelnut oil. Fatty acidsand iodine number were determined by 1 H NMR, whereas 31P NMR was used for the quantification of minor compounds including phenolic compounds, diacylglycerols, sterols, and free fatty acids (free acidity). Classification of the refined oils based on their fatty acids content and the concentration of their minor compounds was achieved by using the forward stepwise canonical discriminant analysis (CDA) and the classification binary trees (CBTs). Both methods providedgood discrimination between the refined hazelnut and olive oils. Different admixtures of refined olive oils with refined hazelnut oils were prepared and analyzed by 1 H NMR and 31P NMR spectroscopy. Subsequent application of CDA to the NMR data allowed the detection of the presence of refined hazelnut oils in refined olive oils at percentages higher than 5%. Application of the non-linear classification method of the binary trees offered better possibilities of measuringadulteration of the refined olive oils at a lower limit of detection than that obtained by the CDA method. The third analytical method exploited, the methodology of shift reagents for the distinction of cis and trans unsaturation in oils and fats. The differential binding of silver ions (in the form of AgFOD) to cis and trans double bonds allowed the separation of the allylic and olefinic proton signals in the 1 H NMR spectra of mixtures of cis and trans methyl esters of aliphatic acids andunsaturated triacylglycerol mixtures at low frequency spectrometers (300 MHz). Careful integration of the appropriate proton resonances in the recorded quantitative 1 H NMR spectra afforded percentage concentrations in very good agreement with the actual values. This 1 H NMR methodology was validated by analyzing AOCS Laboratory Proficiency Program GC samples containing various percentages of saturated, cis-mono unsaturated, and cis-polyunsaturated fat aswell as trans content. This fast and relatively low-cost NMR methodology could be used on line for obtaining nutrition labeling compositional data (NLCD) required for fat-containing food products.

Η παρούσα διατριβή αναφέρεται στην ανάπτυξη και εφαρµογή νέων αναλυτικών µεθόδων, οι οποίες στηρίζονται στη φασµατοσκοπία NMR, για τον ποσοτικό προσδιορισµό ήσσονων συστατικών στη ρίγανη, την ανίχνευση νοθείας ραφιναρισµένου ελαιολάδου µε ραφιναρισµένο φουντουκέλαιο και τον ποσοτικό προσδιορισµό λιπαρών οξέων cis και trans σε λίπη και έλαια. Η πρώτη αναλυτική µέθοδος στηρίχθηκε στη φωσφιτυλίωση των υδροξυλίων των φαινολικών ενώσεων και των τριτερπενικών οξέων της ρίγανης µε το κατάλληλο αντιδραστήριο φωσφόρου και στην ανίχνευση των φωσφιτυλιωµένων παραγώγων µε τη φασµατοσκοπία 31P NMR. Η ανάλυση των φασµάτων έγινε µε βάση τις φασµατικές παραµέτρους πρότυπων φαινολικών ενώσεων, οι οποίες προσδιορίστηκαν στην παρούσα εργασία. Για την ανάθεση των κορυφών στις πρότυπες ενώσεις µε περισσότερες από µια υδροξυλικές οµάδες χρησιµοποιήθηκε συνδυασµός µονοδιάστατης (1 H, 31P) και δισδιάστατης (1H,1H-gCOSY, 31P,1H-HMQC) φασµατοσκοπίας NMR. Με την τεχνική αυτήανιχνεύτηκαν και προσδιορίστηκαν ποσοτικά οι φαινολικές ενώσεις βενζυλική αλκοόλη, θυµόλη, καρβακρόλη, βορνεόλη, cis-3-εξεν-1-όλη, φερουλικό οξύ, χλωρογενικό οξύ, ροσµαρινικό οξύ, απιγενίνη, ταξιφολίνη, ναριγνενίνη, εριοδικτυόλη και τα τριτερπενικά οξέα ουρσολικό και ολεανολικό. Στη δεύτερη αναλυτική µέθοδο η φασµατοσκοπία NMR εφαρµόστηκε για την ανίχνευση νοθείας ραφιναρισµένου ελαιολάδου µε ραφιναρισµένο φουντουκέλαιο. Τα λιπαρά οξέα και ο αριθµός ιωδίου προσδιορίστηκαν µε τη φασµατοσκοπία 1 H NMR, ενώ η φασµατοσκοπία 31P NMR χρησιµοποιήθηκε για τον ποσοτικό προσδιορισµό των ήσσονων συστατικών όπως οι φαινολικέςενώσεις, οι διακυλογλυκερόλες, οι στερόλες και τα ελεύθερα λιπαρά οξέα. Η ταξινόµηση των ελαίων µε βάση την περιεκτικότητά τους σε λιπαρά οξέα και τη συγκέντρωση των ήσσονων συστατικών, επετεύχθη µε χρήση της κανονικής ανάλυσης διακριτότητας (CDA) και των δυαδικών δένδρων ταξινόµησης (CBTs). Και µε τις δύο στατιστικές µεθόδους πραγµατοποιήθηκε καλός διαχωρισµόςµεταξύ των ραφιναρισµένων ελαιολάδων και ραφιναρισµένων φουντουκελαίων. ∆ιαφορετικά µίγµατα των δύο προαναφερθέντων ελαίων παρασκευάστηκαν και αναλύθηκαν µε τη φασµατοσκοπία 1 H και 31P NMR. Εφαρµογή των στατιστικών µεθόδων CDA και CBTs στα αποτελέσµατα NMR επέτρεψε την ανίχνευση νοθείας ραφιναρισµένου ελαιολάδου µε ραφιναρισµένο φουντουκέλαιο σε ποσοστό µικρότερο από 5%. Η τρίτη αναλυτική µέθοδος αξιοποίησε τη µεθοδολογία των µετατοπιζόντων ανιδραστηρίων για τη διάκριση ακόρεστων λιπαρών οξέων cisκαι trans σε λίπη και έλαια. Ο διαφορετικός τρόπος σχηµατισµού συµπλόκων των ιόντων αργύρου (µε τη µορφή µετατοπίζοντος αντιδραστηρίου AgFOD) µε διπλούς δεσµούς, cis και trans, επέτρεψε το διαχωρισµό των σηµάτων που αντιστοιχούν στα αλλυλικά και ολεφινικά πρωτόνια των ακόρεστων λιπαρών οξέων στο φάσµα 1H NMR. Ιδιαίτερη σηµασία αποκτά το γεγονός ότι το πείραµα έγινε σε φασµατογράφο χαµηλής συχνότητας (300MHz). Η εφαρµογή της µεθοδολογίας έγινε σε µίγµατα cis και trans µεθυλεστέρων καθώς και σε µίγµατα ακόρεστων τριακυλογλυκερολών. Με προσεκτική ολοκλήρωση των κατάλληλων κορυφών στο ποσοτικό φάσµα 1 H NMR επετεύχθη ο προσδιορισµός των συγκεντρώσεων των συστατικών των µιγµάτων. Τα αποτελέσµατα συµφώνησανµε τις πραγµατικές συγκεντρώσεις. Η µεθοδολογία 1 H NMR επικυρώθηκε µε τη χρήση πρότυπων δειγµάτων τα οποία περιείχαν κορεσµένα, µονοακόρεστα cis και trans και πολυακόρεστα cis λιπαρά οξέα σε διαφορετικές συγκεντρώσεις. Η ταχύτητα ανάλυσης και το χαµηλό κόστος της συγκεκριµένης µεθοδολογίας ευνοούν την εφαρµογή της στη διατροφική επισήµανση τροφίµων που περιέχουν λίπη.