Αποτίμηση των καθοριστικών παραγόντων της δομής και της αλληλεπίδρασης πεπτιδικών τμημάτων της HIV-1 gp120 V3 περιοχής και του CCR5 συνυποδοχέα των Τ-λεμφοκυττάρων με χρήση φασματοσκοπίας NMR

Abstract

The obstruction of a cell infection by HIV is succeeded either by inhibiting the interaction between the viral gp120 and the CD4 cell receptors or by preventing the gp41 action and deterring the conjuction of gp120 with the CXCR4 and CCR5 chemokine receptors. The role that chemokines and their receptors play at the process of signal transmission, through which the apoptotic mechanisms of non HIV infected cells are activated, appoints the gp120-CCR5/CXCR4 interaction as a highly attractive scientific target for the design of HIV-1 life cycle inhibitors. According to numerous immunological, physicochemical and structural studies the PND V3 region of gp120 and the extracellular N-terminal peptide fragment of CCR5 coreceptor constiture the primary regions that are involved in the interactions of occurring between the two proteins. The sequence variation of the PND V3 region and its correlation with the adopted conformation, the dependence of the position and type of amino-acid with the intensity of the interaction and the linkage of viral tropism with the peptides biologically active conformation comprise fundamental stages in the process of understanding the mechanism of gp120 – CCR5 interaction and the elements that designate it. The thesis interest was oriented towards this direction while its primary targets were the evaluation of the interaction determinants by using peptide fragments, the designation of the interaction type and the calculation of the specific peptides structures through the use of Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy. As expected for free peptides in solution, the peptides representing the PND V3 region of gp120 exhibit conformational flexibility, but they exhibited a large number of NOEs which allowed convergence to a specific conformation. The PND V3 peptides retain the U-turn conformation observed in the crystal structures of gp120 complexes independently of CCR5 presence. The interaction of different regions of the CCR5Nt peptide is gradually increasing proportionally to the positive charge increase in the V3 peptides. The data demonstrate that the PND V3 and CCR5Nt peptide sequences have propensities for interaction and that their binding and selectivity is determined by simple electrostatic attraction mechanisms. The thesis conclusions combined to those extracted by many biological, biochemical and physicochemical studies bring forth new data that can be used in the rational design of inhibitors that will exhibit increased binding affinity for CCR5 co-receptor.

Η παρεμπόδιση της μόλυνσης ενός κυττάρου από τον HIV επιτυγχάνεται ή με αναστολή της αλληλεπίδρασης της ιικής gp120 με τους CD4 υποδοχείς των κυττάρων, είτε παρεμποδίζοντας τη δράση της gp41 ή τέλος αποτρέποντας τη σύζευξη της gp120 με τους CXCR4 και CCR5 υποδοχείς των χημειοκινών. Ο ρόλος όμως των χημειοκινών και των υποδοχέων τους στη διαδικασία μετάδοσης σημάτων, μέσω των οποίων ενεργοποιούνται αποπτωτικοί μηχανισμοί υγιών, μη μολυσμένων από τον HIV κυττάρων, καθιστά την gp120-CCR5/CXCR4 αλληλεπίδραση ιδιαίτερα θελκτικό επιστημονικά στόχο για το σχεδιασμό αναστολέων του κύκλου αναπαραγωγής του ιού. Σύμφωνα με πλήθος ανοσολογικών, φυσικοχημικών και δομικών μελετών η PND V3 περιοχή της gp120 και το εξωκυττάριο αμινο-τελικό πεπτιδικό τμήμα του CCR5 συνυποδοχέα αποτελούν τις κυρίως εμπλεκόμενες περιοχές στην αλληλεπίδραση των δύο πρωτεϊνών. Η μεταβλητότητα της PND V3 ακολουθίας και ο συσχετισμός της με την υιοθετούμενη διαμόρφωση, η σύνδεση της θέσης και του είδους των αμινοξέων με την ένταση της αλληλεπίδρασης και η συνάρτηση του ιικού τροπισμού με τη βιολογικά ενεργή διαμόρφωση των πεπτιδίων αποτελούν θεμελιώδη στάδια στη διαδικασία κατανόησης του μηχανισμού αλληλεπίδρασης της gp120 με τον CCR5 κυτταρικό συνυποδοχέα και των παραγόντων που την καθορίζουν. Προς αυτή την κατεύθυνση εστιάστηκε και το ενδιαφέρον της διατριβής έχοντας ως πρωτογενείς στόχους την αποτίμηση των καθοριστικών παραγόντων της αλληλεπίδρασης χρησιμοποιώντας πεπτιδικά τμήματα των πρωτεϊνών, τον προσδιορισμό του είδους της και την επίλυση της δομής των συγκεκριμένων τμημάτων μέσω Φασματοσκοπίας Πυρηνικού Μαγνητικού Συντονισμού. Όπως ήταν αναμενόμενο για ελεύθερα, μικρά σε μέγεθος μόρια που είναι διαλυμένα σε νερό, τα PND V3 πεπτίδα εμφάνισαν την ιδιότητα της διαμορφωτικής ελευθερίας αλλά παρουσίασαν σημαντικό αριθμό NOE συζεύξεων, γεγονός το οποίο επέτρεψε τη σύγκλισή τους προς μία συγκεκριμένη διαμόρφωση. Η διαμόρφωση τύπου U, η οποία είχε παρατηρηθεί στις κρυσταλλικές δομές συμπλόκων της gp120, διατηρείται ανεξαρτήτως της παρουσίας του CCR5. Τα αποτελέσματα των πειραμάτων της φασματοσκοπίας NMR υποδεικνύουν την ύπαρξη ασθενούς ηλεκτροστατικής αλληλεπίδρασης μεταξύ των PND V3 πεπτιδίων και του CCR5Nt. Η συμμετοχή των πεπτιδικών τμημάτων του CCR5Nt στην αλληλεπίδραση αυξάνει προοδευτικά και φαίνεται να είναι ανάλογη του αριθμού των θετικά φορτισμένων αμινοξέων της ακολουθίας των PND V3 πεπτιδίων και προφανέστατα εξαρτώμενη από την κατιονική τους δύναμη. Τα συμπεράσματα της διατριβής σε συνδυασμό με εκείνα που παράγονται από πλήθος βιολογικών, βιοχημικών και φυσικοχημικών μελετών παράγουν νέα δεδομένα, τα οποία δύναται να χρησιμοποιηθούν στον ορθολογικό σχεδιασμό αναστολέων με αυξημένη συγγένεια δέσμευσης στον συνυποδοχέα CCR5.