Αναστολή της έκφρασης γονιδίων που ενέχονται στην οστεοαρθρίτιδα

Abstract

Osteoarthritis (OA) is the most common disease of the joints, with higher incidence at ages over 60 years. It is a disease that affects all elements of the joint, with most prominent the articular cartilage. It can occur in all joints, with most frequent occurrence in the hand, foot, knee, spine and hip. It is considered a multi-factorial disease, in which genetic contribution has been found to play a significant role in its development and progression,.The developmental stages of the growth-plate differentiation of chondrocytes include proliferation, hypertrophy and finally cell death. The final product of growth-plate chondrocytes’, differentiation and maturation, is the resistant, permanent, adult articular cartilage. Under normal conditions, the chondrocytes in the permanent articular cartilage do not undergo proliferation, hypertrophic differentiation or apoptosis, in contrast with growth-plate chondrocytes. However, osteoarthritic chondrocytes adopt phenotypic characteristics of growth-plate chondrocytes and restart to proliferate and undergo hypertrophic differentiation, under the signal of various transcription and growth factors, enzymes, hormones and cytokines. Hypertrophy in OA is also linked with other phenotypic changes, as cartilage calcification, and has been is a correlation between cartilage calcification, clinical classification of the disease and the expression of collagen type X, a hypertrophy characteristic marker.The active metabolite of vitamin D is 1,25(ΟΗ)2D3, which plays an important role in chondrocytes’ hypertrophy. 1,25(ΟΗ)2D3 binds to its specific receptor VDR and participates in the regulation of genes’ expression, which are involved in hypertrophy and calcification in OA cartilage. Moreover, 1,25(ΟΗ)2D3, contributes to hypertrophic differentiation of chondrocytes, especially close to the calcified area of the cartilage, and in the formation of matrix vesicles in extracellular matrix, which contain Ca2+. Matrix vesicles are responsible for the formation of calcium containing crystals (CPPD, BCP), which erode the cartilage and are correlated with disease progression. Fibroblast growth factor 23 (FGF23) is a phosphaturic factor, which is also involved in the process of cartilage hypertrophy and calcification and promotes the premature differentiation of proliferating growth-plate chondrocytes to hypertrophic. FGF23 binds to specific receptors FGFRs and activates signaling pathways in the target cells. Particularly, FGF23 binding to FGFR1c promotes the activation of MAP-kinase pathway in chondrocytes. Moreover, FGF23 function involves the homeostasis of Ca2+/Pi metabolism and the regulation of 1,25(ΟΗ)2D3 metabolism through repression of 1α-hydroxylase activity. FGF23 has been found to be highly expressed in cells that calcify their extracellular matrix, like osteoblasts and chondrocytes and exhibits differentiated expression before and after calcification. Finally, increased extracellular levels of Pi exhibit important role in cartilage hypertrophy and calcification. Pi enters chondrocytes through Na+/Pi contrasporters, Pit-1, and promotes the expression of hypertrophy-related genes, as RUNX2, osteopontin and osteocalcin.Τhe objective of this study is the investigation of molecules which induce hypertrophy and calcification in osteoarthritic chondrocytes, like 1,25(ΟΗ)2D3 and Pi, the implicated molecular mechanisms and the investigation of the inhibition of their expression. We used articular cartilage samples from osteoarthritic patients, who were undergoing total knee replacement surgery and were not suffering from other rheumatic diseases, chondrodysplasias or autoimmune diseases. The control group was consisted from individuals who were hospitalized for injury or fracture repair. In the experimental part of the thesis were investigated:the role of 1,25(ΟΗ)2D3 through the expression of its receptor VDR in osteoarthritic and normal chondrocytes, the role of Pi through the expression of Na+/Pi cotransporters, Pit-1 και Pit-2 in osteoarthritic and normal chondrocytes, the role of the growth factor FGF23 and the transcription factor RUNX2 in osteoarthritic and normal chondrocytes, as well as their interaction,FGFR1c expression, a specific receptor for FGF23, and the signaling that is activated via FGF23 binding to FGFR1c in osteoarthritic and normal chondrocytes, 1,25(ΟΗ)2D3 or Pi implication in the activation of FGF23 signaling and their role in the induction of hypertrophy in normal chondrocytes,the impact of VDR or Pit-1, Pit-2 inhibition in the inversion of hypertrophic phenotype in OA chondrocytes, the additive effect of 1,25(ΟΗ)2D3 and Pi treatment in the induction of hypertrophy in normal chondrocytes.We observed up-regulated VDR and Pit-1, Pit-2 expression levels in OA chondrocytes compared to normal, suggesting that 1,25(ΟΗ)2D3, via the binding to its receptor VDR exhibits increased transcriptional activity in OA chondrocytes compared to normal. Moreover, we observed that Pi is accumulated in the extracellular matrix of OA chondrocytes and provokes the over-expression of Pit-1, Pit-2 cotransporters in order to enter the cells. We also observed that the phosphaturic growth factor FGF23 and the hypertrophy transcription factor RUNX2 are over-expressed in OA chondrocytes and furthermore FGF23 increases RUNX2 expression. Our data suggest that FGF23 and RUNX2 over-expression and interaction is associated with hypertrophy in OA chondrocytes contributing to disease progression. 1,25(ΟΗ)2D3 or Pi treatment in normal chondrocytes promoted FGF23 and FGFR1c expression and as a consequence activated MAPK pathway and ERK1/2 phosphorylation. The activation of MAPK signaling pathway resulted in the enhancement of hypertrophy-related genes’ expression, like RUNX2, COL10A1, osteopontin, osteocalcin, the induction of the catabolic metalloproteinase-13, and the apoptotic death of chondrocytes. Analysis of FGF23 promoter showed, for the first time, the presence of vitamin D response elements (VDREs), that permit the binding of 1,25(ΟΗ)2D3-VDR complex and the direct regulation of FGF23 transcription. Furthermore, we proceeded with VDR or Pit-1, Pit-2 inhibition in ΟΑ chondrocytes, which resulted in reduced FGF23 and FGFR1c expression, inactivation of MAPK pathway and reduced expression of all markers, as RUNX2, COL10A1, OPN, OC, MMP-13 and finally inhibition of apoptosis. The effect of VDR or Pit-1, Pit-2 inhibition confirms the observations from the 1,25(ΟΗ)2D3 or Pi treatment of normal chondrocytes, and furthermore reveals the mechanism that mediates the effects of 1,25(ΟΗ)2D3 and Pi in OA chondrocytes. The simultaneous inhibition of VDR and Pit-1, Pit-2, resulted in additive significant reduction of FGF23 and FGFR1c expression compared to the individual VDR or Pit-1, Pit-2 inhibition. Moreover, we observed the complete inactivation of MAPK pathway and significant reduced expression of all marker genes (COL10A1, OPN, OC, MMP-13) in ΟΑ chondrocytes.Our findings suggest the implication of 1,25(ΟΗ)2D3 and Pi in hypertrophy and calcification in OA chondrocytes. Specifically, 1,25(ΟΗ)2D3, via its binding to its receptor VDR, exhibited enhanced transcriptional activity in OA chondrocytes, which is further induced by the entry of elevated extracellular Pi levels. Subsequently, 1,25(ΟΗ)2D3 –VDR complex binds to VDREs, which are located in FGF23 promoter and promotes the enhancement of its expression. Then, FGF23 binds to FGFR1c and activates MAPK pathway, resulting in the expression of hypertrophy and ECM calcification related genes and finally to cartilage degeneration. Our results reveal new molecules, as 1,25(ΟΗ)2D3, which could be evaluated as a new therapeutic target.

Η Οστεοαρθρίτιδα (ΟΑ) αποτελεί την πιο κοινή νόσο των αρθρώσεων με μεγαλύτερη επίπτωση σε ηλικίες άνω των 60 ετών. Είναι μία πάθηση που επηρεάζει όλα τα στοιχεία της άρθρωσης κυριότερα όμως τον αρθρικό χόνδρο και που μπορεί να εμφανιστεί σε όλες τις αρθρώσεις με πλέον συχνή εμφάνιση στο χέρι, το πόδι, το γόνατο, τη σπονδυλική στήλη και το ισχίο. Θεωρείται μια πολυπαραγοντική νόσος, στην εμφάνιση και εξέλιξη της οποίας έχει βρεθεί ότι είναι σημαντική η συνεισφορά γενετικών παραγόντων. Η φυσιολογική πορεία της διαφοροποίησης των χονδροκυττάρων στην αναπτυξιακή πλάκα περιλαμβάνει τα στάδια του πολλαπλασιασμού, της υπερτροφίας και τελικά τον κυτταρικό θάνατο. Το προϊόν της διαφοροποίησης και ωρίμανσης των χονδροκυττάρων της αναπτυξιακής πλάκας, είναι ο ανθεκτικός, μόνιμος χόνδρος ενήλικα ατόμου. Τα χονδροκύτταρα του μόνιμου χόνδρου, φυσιολογικά, δεν υφίστανται πολλαπλασιασμό ή υπερτροφική διαφοροποίηση και δεν αποπίπτουν σε αντίθεση με τα χονδροκύτταρα της αναπτυξιακής πλάκας. Παρόλα αυτά, στην οστεοαρθρίτιδα, παρατηρούνται αλλαγές στο προφίλ των χονδροκυττάρων που προσομοιάζουν τα φαινοτυπικά χαρακτηριστικά των χονδροκυττάρων της αναπτυξιακής πλάκας. Συγκεκριμένα, παρατηρείται επανεκκίνηση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και υπερτροφική διαφοροποίηση, στα πλαίσια της οποίας πρωταγωνιστούν ποικίλοι μεταγραφικοί και αυξητικοί παράγοντες, ένζυμα, ορμόνες και κυττοκίνες. Η υπερτροφία στην ΟΑ συνδέεται και με άλλες φαινοτυπικές μεταβολές, όπως την επασβέστωση του χόνδρου και έχει βρεθεί ισχυρή συσχέτιση μεταξύ της επασβέστωσης του χόνδρου, της κλινικής διαβάθμισης της νόσου και της έκφρασης του κολλαγόνου τύπου X, δείκτη χαρακτηριστικού της υπερτροφίας.Σημαντικό ρόλο στην υπερτροφία των χονδροκυττάρων διαδραματίζει η 1,25(ΟΗ)2D3, η οποία αποτελεί τον ενεργό μεταβολίτη της βιταμίνης D. Η 1,25(ΟΗ)2D3 μέσω σύνδεσής της με τον ειδικό υποδοχέα VDR συμμετέχει στη ρύθμιση της έκφρασης γονιδίων που εμπλέκονται στην υπερτροφία και την επασβέστωση του ΟΑ χόνδρου. Επιπλέον, η 1,25(ΟΗ)2D3 συμβάλει στη δημιουργία υπερτροφικών χονδροκυττάρων, κυρίως κοντά στις περιοχές του χόνδρου που έχουν επασβεστωθεί, και στο σχηματισμό μεμβρανικών κυστιδίων, πλούσια σε Pi και Ca2+, στην εξωκυττάρια ουσία (ECM). Τα τελευταία οδηγούν στο σχηματισμό κρυστάλλων ασβεστίου (CPPD, BCP) οι οποίοι διαβρώνουν το χόνδρο και σχετίζονται με την εξέλιξη της ΟΑ. Στη διαδικασία της υπερτροφίας και της επασβέστωσης του χόνδρου συμμετέχει επιπλέον ο αυξητικός παράγοντας των ινοβλαστών (FGF23), ο οποίος αποτελεί έναν φωσφατουρικό παράγοντα που επάγει την πρόωρη μετατροπή των χονδροκυττάρων της αναπτυξιακής πλάκας σε υπερτροφικά. Ο FGF23 προσδένεται σε ειδικούς υποδοχείς FGFRs και ενεργοποιεί σηματοδοτικά μονοπάτια στα κύτταρα στόχους. Ιδιαίτερα, η πρόσδεση του FGF23 στον υποδοχέα FGFR1c προκαλεί την ενεργοποίηση του μονοπατιού των MAP-κινασών στα χονδροκύτταρα. Όσον αφορά στη λειτουργία του, συμμετέχει στη διατήρηση της ομοιοστασίας των ιόντων Ca2+/Pi και στη ρύθμιση του μεταβολισμού της 1,25(ΟΗ)2D3, μέσω καταστολής της δραστηριότητα της 1α-υδροξυλάσης στους νεφρούς. Ο FGF23 εμφανίζει αυξημένη έκφραση σε κύτταρα τα οποία επασβεστώνουν την ECM, όπως οστεοβλάστες και χονδροκύτταρα, και η έκφρασή του διαφοροποιείται πριν και μετά την επασβέστωση. Σημαντικό ρόλο στη διαδικασία της υπερτροφίας και της επασβέστωσης διαδραματίζουν επιπλέον τα αυξημένα επίπεδα Pi. Τα αυξημένα εξωκυττάρια επίπεδα του Pi εισέρχονται στα χονδροκύτταρα μέσω του συμμεταφορέα Na+/Pi, Pit-1 και επάγουν την έκφραση γονιδίων της υπερτροφίας όπως RUNX2, OPN και OC. Αντικείμενο της παρούσας μελέτης αποτελεί η διερεύνηση του ρόλου μορίων που επάγουν την υπερτροφία και την επασβέστωση στα ΟΑ χονδροκύτταρα, όπως η 1,25(OH)2D3 και το Pi, οι εμπλεκόμενοι μηχανισμοί, καθώς και η αναστολή της έκφρασής τους. Στη μελέτη χρησιμοποιήθηκαν δείγματα ασθενών με οστεοαρθρίτιδα που είχαν υποβληθεί σε ολική αρθροπλαστική γόνατος και δεν είχαν άλλες ρευματικές παθήσεις, χονδροδυσπλασίες ή αυτοάνοσα. Την ομάδα ελέγχου αποτέλεσαν άτομα που νοσηλεύτηκαν για λόγους τραυματισμού ή κατάγματος. Αναλυτικότερα, στο πειραματικό μέρος της διατριβής διερευνήθηκαν τα ακόλουθα:ο υπερτροφικός φαινότυπος των χονδροκυττάρων από δείγματα αρθρικού χόνδρου ασθενών με οστεοαρθρίτιδα γόνατος, με τη μελέτη γονιδίων χαρακτηριστικών της υπερτροφίας, όπως τα COL10A1, OPN και OC, η δράση της 1,25(ΟΗ)2D3 μέσω της έκφρασης του υποδοχέα της VDR σε οστεοαρθριτικά και φυσιολογικά χονδροκύτταρα, η δράση του Pi μέσω της έκφρασης των συμμεταφορέων Na+/Pi, Pit-1 και Pit-2 σε οστεοαρθριτικά και φυσιολογικά χονδροκύτταρα, ο ρόλος του αυξητικού παράγοντα FGF23 και του μεταγραφικού παράγοντα RUNX2 σε οστεοαρθριτικά και φυσιολογικά χονδροκύτταρα, καθώς και η μεταξύ τους αλληλεπίδραση,η έκφραση του FGFR1c, ενός ειδικού υποδοχέα του FGF23 και η ενεργοποίηση της σηματοδότησης που επάγεται από την σύνδεσή τους στα οστεοαρθριτικά χονδροκύτταρα συγκριτικά με τα φυσιολογικάο ρόλος της 1,25(ΟΗ)2D3 ή του Pi στην ενεργοποίηση της σηματοδότησης του FGF23 και η συμβολή τους στην επαγωγή της υπερτροφίας σε φυσιολογικά χονδροκύτταρα,ο ρόλος της αναστολής του VDR ή των αντλιών Pit-1, Pit-2 στην αναστροφή του υπερτροφικού φαινότυπου σε οστεοαρθριτικά χονδροκύτταρα, το συνδυαστικό αποτέλεσμα της επίδρασης με 1,25(ΟΗ)2D3 και Pi στην επαγωγή της υπερτροφίας σε φυσιολογικά χονδροκύτταρα.Η ύπαρξη υπερτροφίας επιβεβαιώθηκε σε όλα τα δείγματα ΟΑ χόνδρου που συμπεριλήφθηκαν στη μελέτη με την παρουσία οστεοφύτων και με την ανίχνευση αυξημένης έκφρασης του δείκτη COL10A1. Παρατηρήθηκε αυξημένη έκφραση του υποδοχέα VDR και των Pit-1, Pit-2 στα ΟΑ χονδροκύτταρα σε σχέση με τα φυσιολογικά, προτείνοντας αφενός την αυξημένη μεταγραφική δραστηριότητα της 1,25(ΟΗ)2D3 στα ΟΑ χονδροκύτταρα, μέσω αλληλεπίδρασης με τον υποδοχέα της, και αφετέρου την συσσώρευση του Pi στο εξωκυττάριο στρώμα των ΟΑ χονδροκυττάρων, το οποίο προκαλεί υπερέκφραση των αντλιών Pit-1, Pit-2, προκειμένου να εισέλθει στο κυτταρόπλασμά τους. Επίσης παρατηρήθηκε ότι τόσο ο φωσφατουρικός αυξητικός παράγοντας FGF23 όσο και ο μεταγραφικός παράγοντας της υπερτροφίας RUNX2 υπερεκφράζονται στα ΟΑ χονδροκύτταρα και μάλιστα ο FGF23 επάγει την έκφραση του RUNX2. Έτσι προτείνεται ότι η υπρέκφρασή τους αλλά και η αλληλεπίδρασή τους, σχετίζεται με την υπερτροφία στα ΟΑ χονδροκύτταρα, συμβάλλοντας στην εξέλιξη της νόσου. Η επίδραση με 1,25(ΟΗ)2D3 ή Pi στα φυσιολογικά χονδροκύτταρα είχε ως αποτέλεσμα την επαγωγή της έκφρασης του FGF23 και του υποδοχέα του FGFR1c και ως ακολούθως την ενεργοποίηση του μονοπατιού των ΜΑP-κινασών και τη φωσφορυλίωση της ERK1/2. Η ενεργοποίηση του ανωτέρου σηματοδοτικού μονοπατιού είχε ως αποτέλεσμα την ενίσχυση της έκφρασης γονιδίων χαρακτηριστικών της υπερτροφίας, όπως τα RUNX2, COL10A1, οστεοποντίνη (OPN), οστεοκαλσίνη (OC), την επαγωγή καταβολικών μορίων όπως μεταλλοπρωτεϊνάση-13 (MMP-13) αλλά και την απόπτωση των χονδροκυττάρων. Ανάλυση του υποκινητή του FGF23, έδειξε για πρώτη φορά, ότι διαθέτει περιοχές δέσμευσης του συμπλόκου 1,25(ΟΗ)2D3-VDR, γεγονός που υποδηλώνει ότι η επαγωγή της έκφρασής του FGF23 από τη 1,25(ΟΗ)2D3 πραγματοποιείται άμεσα με την πρόσδεση του συμπλόκου στον υποκινητή του. Στη συνέχεια, ακολούθησε αναστολή του VDR ή των Pit-1, Pit-2 στα ΟΑ χονδροκύτταρα, η οποία προκάλεσε την αναστολή της έκφρασης των FGF23 και FGFR1c, απενεργοποίηση του μονοπατιού MAP-κινασών και μείωση της έκφρασης όλων των δεικτών, RUNX2, COL10A1, OPN, OC, MMP-13 και της απόπτωσης. Το αποτέλεσμα της αναστολής του VDR ή των Pit-1, Pit-2, επιβεβαιώνει τα αποτελέσματα που προέκυψαν μετά από επίδραση με 1,25(ΟΗ)2D3 ή με Pi στα φυσιολογικά χονδροκύτταρα και επιπρόσθετα αναδεικνύει τον μηχανισμό μέσω του οποίου διενεργούνται οι δράσεις της 1,25(ΟΗ)2D3 και του Pi στα ΟΑ χονδροκύτταρα. Ταυτόχρονη αναστολή του VDR και των Pit-1, Pit-2, οδήγησε σε στατιστικά σημαντική μείωση της έκφρασης των FGF23 και FGFR1c συγκριτικά με τη μεμονωμένη αναστολή του VDR ή των Pit-1, Pit-2. Επίσης διαπιστώθηκε μεγαλύτερη απώλεια στη φωσφορυλίωση της ERK1/2 και στατιστικά σημαντική μείωση όλων των γονιδίων-δεικτών (COL10A1, OPN, OC, MMP-13) στα ΟΑ χονδροκύτταρα.Τα αποτελέσματα μας υποστηρίζουν την εμπλοκή της 1,25(ΟΗ)2D3 και του Pi στην υπερτροφία και την επασβέστωση των ΟΑ χονδροκυττάρων. Συγκεκριμένα η 1,25(ΟΗ)2D3 μέσω σύνδεσης της στον υποδοχέα VDR, εμφανίζει αυξημένη μεταγραφική δραστηριότητα στα ΟΑ χονδροκύτταρα, η οποία ενισχύεται περαιτέρω από τη είσοδο αυξημένων επιπέδων Pi στα χονδροκύτταρα μέσω των Pit-1, Pit-2. Στη συνέχεια, το σύμπλοκο 1,25(ΟΗ)2D3 -VDR προσδένεται σε ειδικές περιοχές στον υποκινητή του FGF23 και προκαλεί την ενίσχυση της έκφρασής του. Με τη σειρά του, ο FGF23 προσδένεται στον υποδοχέα FGFR1c και ενεργοποιεί το μονοπάτι των MAP-κινασών, με στόχο την αύξηση της έκφρασης δεικτών της υπερτροφίας και της επασβέστωσης του ECM με τελικό αποτέλεσμα τον εκφυλισμό του χόνδρου. Τα δεδομένα που προέκυψαν από τη μελέτη αναδεικνύουν νέα μόρια, όπως η 1,25(ΟΗ)2D3, που θα μπορούσαν να συνεισφέρουν στο σχεδιασμό νέων θεραπευτικών στόχων.