Μελέτη του ρόλου της θηλής του μαστού στην παθογένεια της μαστίτιδας των προβάτων

Abstract

The objective of the present thesis was to elucidate (a) processes that take place during the initial stage of mammary infection, specifically in relation to bacterial entrance into the teat, (b) the possible role of bacterila flora in the teat, (c) the inflammatory reaction of the animal during the acute phase of the disease, (d) cellular sub-populations in the teat and (e) the possible role of lymphocytes in protecting the mammary gland.The thesis is divided into six chapters followed by the general discussion.In the first chapter, the relevant literature is reviewed. The chapter is subdivided into two parts. In part A, the literature on the anatomy and histology of the teat of ewes is briefly reviewed. In part B, the defences of the teat and the mammary gland are described.In the second chapter, a study, with objective to investigate whether teat lesions in ewes would facilitate the ascent of M. haemolytica into the mammary gland and subsequent colonization, is described. Two experiments were carried out. In the first experiment, 12 ewes were divided into one of two equal groups (n=6); ewes in group A were challenged with M. haemolytica recovered from the mammary gland of a ewe and ewes in group B were challenged with M. haemolytica recovered from the tonsils of a lamb. In each ewe, the left teat was chapped (CP) and then challenged (CH), a treatment referred to as CP+/CH+; the right teat was challenged but not chapped (CP-/CH+). In the second experiment, eight ewes, each with two lambs were used. The procedures were as described for the first experiment I, except that the ewes continued to suckle their lambs and were not deliberately challenged. Infection of the teat skin, teat duct and mammary gland were monitored by means of conventional bacteriological techniques. In experiment I, four ewes developed clinical mastitis and the remaining eight ewes subclinical mastitis in the left (CP+/CH+) mammary gland, whilst only ewe developed sublinical mastitis in the right (CP-/CH+) gland. M. haemolytica was recovered from 75 of the 120 (75/120) samples of teat duct material and from 44/120 mammary secretion samples from the left (CP+/CH+) side. Respective results in the right (CP-/CH+) side were 25/120 and 1/120. Estimated time to infection for the left (CP+/CH+) side was 0.5 day, whilst for the right (CP-/CH+) side, the median time to infection was 2.5 days (P=0.003). The duration of infection was also different, with a median of 7.25 days for the left compared with 2.0 days for the right teat (P=0.003). Isolation from the milk of the left glands lasted 1.0 to 7.5 days with a median value of 4 days, whilst isolation from the only right gland lasted 1 day. The two strains of M. haemolytica used (ewes of group A or group B) did not differ significantly in respect of the mean duration of isolation from the teat duct (6 and 8.5 days; P=0.176) or the milk (3 and 4 days; P=0.324). In the second experiment, two ewes developed clinical mastitis and one subclinical mastitis on the left (CP+/CH-) mammary gland; one ewe died five days after chapping. None of the ewes developed mastitis on the right (CP-/CH-) mammary gland. Bacteria (Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus. aureus and M. haemolytica) were isolated from 7/8 left (CP+/CH-) teat ducts and from 1/8 right (CP-/CH-) teat ducts (P=0.03); bacteriological positive samples were 21/144 and 2/144, respectively.In the third chapter, the reactions after experimental deposition of a mammary or respiratory M. haemolytica into the ovine teat duct.A M. haemolytica isolate was deposited into one teat of 25 ewes and the clinical, ultrasonographic, bacteriological, cytological, haematological, physicochemical, gross-pathological, histological and immunohistochemical reactions were monitored. Clinical and ultrasonographic changes were evident by 8 h after challenge, but subsided by 2 and 4 d after challenge, respectively. The organism was consistently isolated from samples of teat duct material (142/150), but not from mammary secretion (54/150). The California Mastitis Test scores increased (>"1") and remained high (143/150 samples). Polymorphonuclear neutrophils (PMN) predominated (≥85%) in milk films up to 1 d after challenge, but the proportion of lymphocytes and macrophages progressively increased (5%-20% and 10-40%, respectively) thereafter. Total blood leukocyte counts decreased immediately after challenge, then rose (10933 cells μl-1) until 1 day after challenge (P=0.01 over time); immature PMNs were >3% of total after challenge. Significant change over time was also evident for immature neutrophils (P<0.001) and for lymphocytes (P=0.008). Increased pH values (>7.0) were recorded in milk from the challenged side; median values were 6.82 up to 8 h after challenge, 7.20 from 12 h after challenge up to D1 and 6.95 from D2 up to D5; respective figures for milk from control sides were 6.70, 6.72 and 6.73 (P<0.01 from 4h after challenge up to and including D1). Compared to pre-challenge values, fat, total protein and lactose content of milk decreased significantly after challenge. Moreover, fat, protein and lactose content of milk from inoculated sides was significantly smaller to that of the contralateral sides. The median fat content of milk from challenged sides was 4.50% and that of control sides 7.00% (P<0.045 throughout); median total protein content of milk from challenged sides was 5.00% and that of control sides was 5.65% (P<0.03 up to and including 3 d after challenge); lactose content was 3.55% and 4.55% (P<0.03 up to and including 3 d after challenge). Histologically, there was prominent leucocytic (PMNs, lymphocytes, plasma cells) infiltration in clusters under the epithelium of the teat. Polymorphonuclear neutrophils were more prominent at the border between teat duct and teat cistern in ewes euthanatized 4 h after challenge and thereafter; they also extended into the teat cistern in the ewes euthanatized 1 d after challenge and thereafter. Three and 5 d after challenge, a follicle-like structure, characterized by accumulation of lymphocytes and plasma cells, with an apparent germinal centre, was observed in the lamina propria between the teat duct and the teat cistern. In teat tissue samples, CD79+, CD3+, γδ-T cells+, CD68+ and MHC-II+ cells were present; there was an increase of CD8+ cells from 3 d to 5 d after challenge (P=0.005). Immunohistochemistry scores in supra-mammary lymph nodes of the challenged side were either similar to or higher than in the control side: for CD79+ P=0.005, for CD3+ P=0,585, for γδ+ P=0.099, for CD4+ P=0.004, for CD8+ P=0.585, for CD68+ P<0.001, and for MHC-II+ cells P=0.063. The numbers of CD79+, CD4+ and CD68+ cells were also significantly higher in ewes euthanatized at later days after challenge (P=0.01, P=0.05 and P<0.001, respectively). At each time-point, the number of CD8+ cells was significantly smaller than that of all other cells (P<0.003).Subsequently, 36 ewes were allocated into three groups: A (with clinically healthy teats and challenged into the teat duct), B (with experimentally chapped teats and challenged into the teat duct) and C (challenged in the mammary gland) (n=12), and were subdivided into four subgroups. Each subgroup was challenged with one of the following M. haemolytica strains: strain DAG21T from the teat duct of a ewe, strain DAG21R from the tonsils of a lamb and strains VSM08L and ES26L of known pathogenicity for the ovine mammary gland. Ewes in group A developed subclinical mastitis, whilst ewes in groups B and C developed clinical mastitis. M. haemolytica was isolated from 38/72 samples in group A, 72/72 samples in group B and 37/72 samples in group C. The CMT was positive in 24/36, 36/36 and 36/36 mammary secretion samples, respectively. Scores for pathological findings were 50, 150 and 79, respectively (maximum possible: 192). There were no statistically significant differences between groups (P>0.9).In the fourth chapter, the possible effects of bacterial populations within the teat duct, in the pathogenesis of ovine mastitis were studied. Clinical, bacteriological, cytological and pathological methods were used. In the first experiment, 32 ewes were allocated into group A (n=8; ewes from whose teat duct coagulase-negative staphylococci were isolated [+++ growth]), B (n=8; ewes from whose teat duct coagulase-negative staphylococci were isolated [+ growth]) or C (n=8; ewes from whose teat duct Bacillus spp. were isolated) and subdivided into A1, B1, C1 (n=4; challenged by deposition of M. haemolytica into the teat duct) or A2, B2, C2 (n=4; used as uninoculated controls); group D (n=8) contained ewes with no bacteria in their teat ducts and challenged by deposition of M. haemolytica into the teat duct). There were less bacteriological isolations of pre-existing flora (P<0.02) and challenge (P<0.05) organisms from teat duct of A1 than of A2 or D ewes; the severity of pathological findings in A1 (summed up score: 27, maximum possible: 64) ewes was smaller than in D (summed up score: 72, maximum possible: 128) ewes (P=0.038). No such findings were evident with B1 or C1 ewes. In the second experiment, ewes (groups E and F, n=6) from whose teat duct coagulase-negative staphylococci were isolated, were used; in group G (n=6) ewes with no bacteria in their teat ducts, were included. Teat chapping was applied in both teats of E and in one teat of G ewes, whilst teats of F ewes were not chapped. All E ewes developed acute clinical mastitis within 24 h after teat chapping, although no bacterial challenge had been carried out; there were more bacteriological isolations of pre-existing flora organisms from E (71/72 samples) than from F (36/72 sampels) or G (0/72 sampels) ewes (P<0.001); the severity of pathological findings in E (score: 28, maximum possible: 32) was greater than in F (score: 3, maximum possible: 32) or G (score: 14, maximum possible: 32) ewes. In the third experiment, 8 ewes with no bacteria in their teat ducts were allocated into group H or I (n=4) and challenged into the teat duct (group H) or into the mammary gland (group I) with a Staphylococcus simulans isolate previously recovered from the teat duct of a group E ewe (2nd experiment above). Group H ewes developed transiently clinical followed by subclinical mastitis, whilst group I ewes developed severe clinical disease. S. simulans was isolated from 38/48 samples from group H ewes and from 28/48 samples from group I; the score of severity of pathological findings in group H ewes was 22 and in group I ewes 16 (maximum possible: 32).In the fifth chapter, the histological findings in the teat of ewe-lambs are presented. Twenty-four clinically healthy teats from 12 pre-pubertal ewe-lambs were examined bacteriologically and histologically. No bacteria were isolated from any of these teats. No pathological findings were evident in any teat. The epithelial cells were characteristically under-developed. Subjacent to the teat cistern epithelium, lymphocytes were evident in six teats (25%) from three ewes, i.e. the cells were observed in both teats of the same ewes. These lymphocytes were observed as aggregates in small numbers, but with no germinal activity, at the border between teat duct and teat cistern.In the sixth Chapter, the differences in susceptibility to M. haemolytica-associated mastitis, between two different breeds of dairy sheep are presented. A M. haemolytica isolate was deposited into the teat duct of Karagouniko (group K, n=8) or Frisarta (group F, n=8) ewes. The animals were monitored by means of clinical, bacteriological, cytological and pathological methods. K-group ewes did not develop any clinical signs, whilst F ewes became ill and developed acute clinical mastitis by 1 d after challenge (P<0.001). Bacteria were isolated from 34/48 samples from K-group ewes and from 46/46 samples from F-group ewes (P<0.03 up to 1 d after challenge, P>0.2 thereafter). Positive CMT results were observed in 17/24 samples from K-group ewes and in 23/23 samples from F-group ewes; leucocytes were seen in Giemsa-stained films. Total pathology score summed over all group K ewes was 41 (maximum possible: 128); M. haemolytica was isolated from 12/24 tissue samples. Total pathology score summed over all group F ewes was 93 (maximum possible: 128); M. haemolytica was isolated from 24/24 tissue samples. Follicle-like structures, characterized by accumulation of lymphocytes and plasma cells, with an apparent germinal centre were present at the border between teat duct - teat cistern of group K ewes; no such structures were observed in teats of group F ewes.General and more specific conclusions deriving from the results of the present thesis are as follows.(a) Lymphocytes constitute an important defence mechanism of the teat of ewes. Lymphocytes in infected teats may contribute to an organized defence of the host when macrophages and PMNs fail because of bacterial virulence. The area of lymphocytic accumulation in the teat seems to be an inducible-lymphoid-follicle-like structure, which acts as a locally organized immune defence. Presence of plasma cells indicates a possible role for humoral immunity in the teat. Presence of these structures in pre-pubertal ewe-lambs supports the view regarding their innate defensive character. There seem to be breed differences in the activation and the function of these structures, which may reflect possible differences in susceptibility to mastitis.(b) There are no differences in the pathogenic action between "mammary" and "respiratory" strains of M. haemolytica. Under favourable conditions, respiratory strains can invade into the teat and the mammary gland. These strains can cause mastitis of various degree, depending on the efficiency of the teat defence mechanisms. The findings support the theory regarding transmission of this organism from the lamb to its dam during sucking.(c) Bacterial flora present in the teat duct plays an important role in mastitis pathogenesis. Staphylococcal flora in the teat can afford some degree of protection against invading microorganisms. However, in case of impeded defence mechanisms of the teat, the same bacterial flora can invade into the mammary parenhcyma and cause clinical mastitis.Suggestions for further research continuing the results of the present thesis are as follows.(a) Exploitation and immuno-enhancement of the teat defences for effective prevention of mastitis in ewes. (b) Study of possible genetic differences among animals, regarding the teat defences of ewes.

Η παρούσα διατριβή αποσκοπεί στη μελέτη: (α) των διεργασιών που λαμβάνουν χώρα στο αρχικό στάδιο της μόλυνσης του μαστικού αδένα των προβατίνων, ιδιαίτερα σε σχέση με τη διείσδυση των βακτηρίων στη θηλή του μαστού, (β) του πιθανού ρόλου της υπάρχουσας στη θηλή βακτηριακής χλωρίδας, (γ) της φλεγμονώδους αντίδρασης κατά την οξεία φάση της μόλυνσης, (δ) των κυτταρικών υποπληθυσμών στη θηλή του μαστού και (ε) του ρόλου των λεμφοκυττάρων στην προστασία του μαστικού αδένα. Η διατριβή χωρίζεται σε έξι κεφάλαια και ακολουθεί η γενική συζήτηση.Στο κεφάλαιο I, ανασκοπείται η σχετική βιβλιογραφία. Το κεφάλαιο υποδιαιρείται σε δύο ενότητες. Στην πρώτη, ανασκοπείται η βιβλιογραφία που αφορά στη μακροσκοπική ανατομική και στην ιστολογία της θηλής του μαστού των προβάτων. Στη δεύτερη, περιγράφονται οι αμυντικοί μηχανισμοί που αναπτύσσονται στη θηλή και το μαστικό αδένα.Στο κεφάλαιο II, αξιολογήθηκε η σημασία των αλλοιώσεων της θηλής του μαστού στη διείσδυση βακτηρίων στο θηλαίο πόρο. Πραγματοποιήθηκαν δύο πειραματισμοί. Στον πρώτο, 12 προβατίνες χωρίστηκαν σε δύο ομάδες Α ή Β (n=6) και προκλήθηκαν αλλοιώσεις στο δέρμα της αριστερής θηλής (Α+), ενώ στη δεξιά θηλή δεν έγινε καμία παρέμβαση (Α-). Στη συνέχεια, στο δέρμα γύρω από το κάτω άκρο των δύο θηλών των ζώων της ομάδας Α έγινε επάλειψη θρεπτικού υλικού (Μ+) με Mannheimia haemolytica (στέλεχος από μαστό προβατίνας = "μαστικό" στέλεχος). Στο δέρμα γύρω από το κάτω άκρο των δύο θηλών των ζώων της ομάδας Β έγινε επίσης επάλειψη θρεπτικού υλικού (Μ+) με M. haemolytica (στέλεχος από ανώτερη αναπνευστική οδό αρνιού = "αναπνευστικό" στέλεχος). Στο δεύτερο πειραματισμό, χρησιμοποιήθηκαν οκτώ προβατίνες, προκλήθηκαν δε αλλοιώσεις (Α+) στην αριστερή θηλή τους, ενώ στη δεξιά τους δεν έγινε καμία παρέμβαση (Α-). Οι προβατίνες γαλουχούσαν τα αρνιά τους και και δεν έγινε καμία άλλη παρέμβαση (Μ-). Στη συνέχεια, συλλέγονταν τακτικά δείγματα υλικού θηλαίου πόρου και γάλακτος για βακτηριολογική και κυτταρολογική εξέταση. Στον πρώτο πειραματισμό, τέσσερις προβατίνες εκδήλωσαν κλινική μαστίτιδα και οκτώ προβατίνες υποκλινική μαστίτιδα στον αριστερό μαστικό αδένα (Α+/Μ+), ενώ μόνο μία εκδήλωσε υποκλινική μαστίτιδα στο δεξιό (Α-/Μ+). Απομονώθηκε M. haemolytica από 75 από τα 120 (75/120) δείγματα υλικού θηλαίου πόρου και από 44/120 δείγματα μαστικού εκκρίματος του αριστερού ημιμορίου (Α+/Μ+). Τα αντίστοιχα αποτελέσματα στο δεξιό ημιμόριο (Α-/Μ+) ήταν 25/120 και 1/120. Η διάμεση τιμή του απαιτούμενου χρονικού διαστήματος για την απομόνωση του βακτηρίου από τον αριστερό θηλαίο πόρο ήταν 0,5 ημέρα, ενώ από το δεξιό θηλαίο πόρο ήταν 2,5 ημέρες (P=0,003). Η διάμεση τιμή της χρονικής διάρκειας απομόνωσής του ήταν 7,25 ημέρες για τον αριστερό θηλαίο πόρο και 2 ημέρες για το δεξιό (P=0,003). Η διάμεση τιμή της χρονικής διάρκειας απομόνωσής του ήταν 4 ημέρες (διακύμανση: 1-7,5 ημέρες) για το γάλα του αριστερού μαστικού αδένα, ενώ η τιμή της χρονικής διάρκειας απομόνωσης για το γάλα του δεξιού μαστικού αδένα ήταν 1 ημέρα. Δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές στη χρονική διάρκεια απομόνωσης μεταξύ των δύο στελεχών M. haemolytica που ενοφθαλμίστηκαν (P>0,15). Στο δεύτερο πειραματισμό, δύο προβατίνες εκδήλωσαν κλινική μαστίτιδα και μία προβατίνα υποκλινική μαστίτιδα στον αριστερό μαστικό αδένα (Α+/Μ-), μία δε από αυτές πέθανε. Κανένα ζώο δεν εκδήλωσε μαστίτιδα στο δεξιό αδένα (Α-/Μ-). Απομονώθηκαν βακτήρια (Staphylococcus spp. ή M. haemolytica) από 21/144 δείγματα του ημιμορίου Α+/Μ- και από 2/144 δείγματα του ημιμορίου Α-/Μ-.Στο κεφάλαιο III παρουσιάζονται οι συνέπειες του ενοφθαλμισμού ενός "μαστικού" ή ενός "αναπνευστικού" στελέχους M. haemolytica σε μία θηλή του μαστού προβατίνων.Αρχικά, παρατίθενται τα αποτελέσματα που πρέκυψαν από τον ενοφθαλμισμό ενός στελέχους M. haemolytica στον ένα θηλαίο πόρο 25 κλινικά υγιών προβατίνων. Στη συνέχεια, καταγράφηκαν οι αντιδράσεις που προέκυψαν, χρησιμοποιώντας κλινικές, υπερηχοτομογραφικές, βακτηριολογικές, κυτταρολογικές, αιματολογικές, φυσικοχημικές, παθολογοανατομικές και ανοσοϊστοχημικές μεθόδους. Κατά την κλινική και υπερηχοτομογραφική εξέταση παρατηρήθηκαν μεταβολές 8 ώρες μετά τον ενοφθαλμισμό, οι οποίες υποχώρησαν μετά από 1 και 3 ημέρες, αντίστοιχα, μετά τον ενοφθαλμισμό. Το βακτήριο απομονώθηκε από 142/150 δείγματα υλικού θηλαίου πόρου και 54/150 δείγματα γάλακτος. Η αντίδραση της δοκιμής California Mastitis Test (CMT) ήταν ≥"1" (δηλαδή ενδεικτική ύπαρξης αυξημένου αριθμού λευκοκυττάρων) σε 143/150 δείγματα γάλακτος. Ο συνολικός αριθμός λευκοκυττάρων στο αίμα μειώθηκε δραματικά αμέσως μετά τον ενοφθαλμισμό, στη συνέχεια όμως αυξήθηκε (Ρ=0,01 σε σχέση με το χρόνο). Τα άωρα ουδετερόφιλα λευκοκύτταρα αποτελούσαν περισσότερο από 3% του συνολικού αριθμού των ουδετερόφιλων λευκοκυττάρων στο αίμα. Αντίστοιχη στατιστική σημαντικότητα παρατηρήθηκε και για τις μεταβολές του αριθμού των άωρων ουδετερόφιλων λευκοκυττάρων (Ρ<0,001) και των λεμφοκυττάρων (Ρ=0,008). Παρατηρήθηκε αύξηση του pH (>7,0) του γάλακτος των ενοφθαλμισμένων ημιμορίων (P<0,01 από 4 ώρες μετά τον ενοφθαλμισμό μέχρι και 1 ημέρα μετά τον ενοφθαλμισμό). Η διάμεση τιμή της περιεκτικότητας σε λίπος ήταν 4,50% στο γάλα από τα ενοφθαλμισμένα ημιμόρια και 7,00% στο γάλα από τα μη ενοφθαλμισμένα ημιμόρια (P<0,045). Η αντίστοιχη τιμή για τις ολικές πρωτεΐνες ήταν 5,00% στο γάλα από τα ενοφθαλμισμένα ημιμόρια και 5,65% στο γάλα από τα μη ενοφθαλμισμένα ημιμόρια (P<0,03 για τις διαφορές μέχρι και την 3η ημέρα μετά τον ενοφθαλμισμό). Η αντίστοιχη τιμή για τη λακτόζη ήταν 3,55% στο γάλα από τα ενοφθαλμισμένα ημιμόρια και 4,55% στο γάλα από τα μη ενοφθαλμισμένα ημιμόρια (P<0,03 για τις διαφορές μέχρι και την 3η ημέρα μετά τον ενοφθαλμισμό). Το κύριο ιστοπαθολογικό εύρημα στη θηλή ήταν η έντονη λευκοκυτταρική διήθηση του επιθηλίου, η οποία ήταν αυξημένη στο όριο μεταξύ θηλαίου πόρου και θηλαίου κόλπου, καθώς και στο θηλαίο κόλπο. Παρατηρήθηκαν ουδετερόφιλα λευκοκύτταρα, λεμφοκύτταρα και πλασμοκύτταρα. Παρατηρήθηκαν επίσης συναθροίσεις λεμφοκυττάρων με εικόνα χαρακτηριστική θυλακίου, με ή χωρίς ενεργοποιημένα λεμφοκύτταρα και βλαστική δραστηριότητα, στο όριο μεταξύ θηλαίου πόρου και θηλαίου κόλπου. Στα δείγματα από τις θηλές, ανιχνεύθηκαν Β-λεμφοκύτταρα (CD79+), Τ-λεμφοκύτταρα (CD3+), γδ-Τ-λεμφοκύτταρα (γδ+) και παράγοντες του μείζονος συμπλέγματος ιστοσυμβατότητας 2ης τάξης (MHC-II+), εντός της περιοχής συνάθροισης λεμφοκυττάρων. Παρατηρήθηκε διαφορά στον αριθμό των Τ-κυτταροτοξικών λεμφοκυττάρων (CD8+) μεταξύ της 3ης και της 5ης ημέρας μετά τον ενοφθαλμισμό (P=0,005). Η στατιστική σημαντικότητα της διαφοράς στην τελική τιμή των ανοσοϊστοχημικών ευρημάτων των μαστικών λεμφογαγγλίων (άθροισμα των αποτελεσμάτων των πέντε ανατομικών περιοχών κάθε λεμφογαγγλίου) μεταξύ των ενοφθαλμισμένων και των μη ενοφθαλμισμένων ημιμορίων ήταν P=0,005 για τα Β-λεμφοκύτταρα (CD79+), P=0,585 για τα Τ-λεμφοκύτταρα (CD3+), P=0,099 για τα γδ-Τ-λεμφοκύτταρα (γδ+), P=0,004 για τα Τ-βοηθητικά λεμφοκύτταρα (CD4+), P=0,585 για τα Τ-κυτταροτοξικά λεμφοκύτταρα (CD8+), P<0,001 για τα μακροφάγα (CD68+) και P=0,063 για τους παράγοντες μείζονος συμπλέγματος ιστοσυμβατότητας 2ης τάξης (MHC-II+). Υπήρχε στατιστικά σημαντική διαφορά στην τελική τιμή των ανοσοϊστοχημικών ευρημάτων μεταξύ των χρονικών σημείων του πειραματισμού για τα Β-λεμφοκύτταρα (CD79+, P=0,01), για τα Τ-βοηθητικά λεμφοκύτταρα (CD4+, P<0,001) και για τα μακροφάγα (CD68+, P<0,001). Σε επόμενο πειραματισμό, χρησιμοποιήθηκαν 36 προβατίνες Καραγκούνικης φυλής, οι οποίες χωρίστηκαν στις εξής ομάδες: ομάδα Α (ζώα με κλινικά υγιείς θηλές του μαστού, οι οποίες ενοφθαλμίστηκαν στον ένα θηλαίο πόρο τους), ομάδα Β (ζώα σε μία θηλή του μαστού των οποίων προκλήθηκαν δερματικές αλλοιώσεις και, στη συνέχεια, ενοφθαλμίστηκαν στον αντίστοιχο θηλαίο πόρο τους) και ομάδα Γ (ζώα στα οποία ο ενοφθαλμισμός έγινε απευθείας σε ένα μαστικό αδένα) (n=12). Κάθε ομάδα χωρίστηκε περαιτέρω σε τέσσερις υποομάδες, σε καθεμιά από τις οποίες χρησιμοποιήθηκε διαφορετικό στέλεχος M. haemolytica για τον ενοφθαλμισμό των ζώων. Το στέλεχος DAG21T είχε απομονωθεί από το θηλαίο πόρο μίας προβατίνας (n=4) και το στέλεχος DAG21R είχε απομονωθεί από την ανώτερη αναπνευστική οδό ενός αρνιού (n=4). Τα στελέχη VSM08L (n=2) και ES26L (n=2) είχαν τεκμηριωμένη παθογόνο δράση για το μαστικό αδένα των προβατίνων. Οι προβατίνες στην ομάδα Α εκδήλωσαν υποκλινική μαστίτιδα, ενώ αυτές στην ομάδα Β και Γ κλινική μαστίτιδα. Το βακτήριο απομονώθηκε από 38/72 δείγματα από την ομάδα Α, από 72/72 δείγματα από την ομάδα Β και από 37/72 δείγματα από την ομάδα Γ. Η αντίδραση της δοκιμής CMT ήταν ≥"1" σε 24/36, 36/36 και 36/36 δείγματα μαστικού εκκρίματος, αντίστοιχα. Η τιμή της βαρύτητας των παθολογοανατομικών ευρημάτων ήταν 50, 150 και 79, για την ομάδα Α, Β και Γ αντίστοιχα (μέγιστη δυνατή τιμή: 192). Καμία από τις παραπάνω διαφορές μεταξύ των υποομάδων δεν ήταν σημαντική (P>0,9).Στο κεφάλαιο IV, παρουσιάζεται η σημασία της βακτηριακής χλωρίδας που βρίσκεται στη θηλή του μαστού της προβατίνας, για την παθογένεια της μαστίτιδας. Στον πρώτο πειραματισμό, χρησιμοποιήθηκαν 24 προβατίνες, οι οποίες χωρίστηκαν ως εξής (n=8): ομάδα Α (από το θηλαίο πόρο των ζώων αυτών απομονώθηκαν πηκτάση-αρνητικοί σταφυλόκοκκοι σε έντονη [+++] ανάπτυξη), ομάδα Β (από το θηλαίο πόρο των ζώων αυτών απομονώθηκαν πηκτάση-αρνητικοί σταφυλόκοκκοι σε μέτρια [+] ανάπτυξη) και ομάδα Γ (από το θηλαίο πόρο των ζώων αυτών απομονώθηκαν Bacillus spp.). Κάθε ομάδα χωρίστηκε περαιτέρω σε δύο υποομάδες: υποομάδα 1 (n=4) με ζώα στα οποία έγινε ενοφθαλμισμός M. haemolytica στο θηλαίο πόρο τους και υποομάδα 2 (n=4) με ζώα τα οποία χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες. Επιπλέον, χρησιμοποιήθηκαν ζώα-μάρτυρες χωρίς βακτήρια στους θηλαίους πόρους (ομάδα Δ, n=8), στα οποία έγινε ενοφθαλμισμός M. haemolytica σε ένα θηλαίο πόρο τους. Απομονώθηκαν η εκάστοτε προϋπάρχουσα βακτηριακή χλωρίδα και M. haemolytica σε μικρότερη συχνότητα από τα ζώα της ομάδας Α1 παρά από τα ζώα της ομάδας Α2 ή Δ (P<0,02 και P<0,05, αντίστοιχα). Επιπλέον, η τιμή της βαρύτητας των παθολογοανατομικών ευρημάτων στην υποομάδα Α1 ήταν 27 (μέγιστη δυνατή τιμή: 64), σημαντικά μικρότερη από αυτή στην ομάδα Δ που ήταν 72 (μέγιστη δυνατή τιμή: 128) (P=0,038). Ανάλογα βακτηριολογικά ή παθολογοανατομικά ευρήματα δεν παρατηρήθηκαν στις ομάδες Β και Γ. Στο δεύτερο πειραματισμό, χρησιμοποιήθηκαν 18 προβατίνες, οι οποίες χωρίστηκαν ως εξής (n=6): ομάδα Ε και ομάδα ΣΤ (από τους θηλαίους πόρους των ζώων αυτών απομονώθηκαν πηκτάση-αρνητικοί σταφυλόκοκκοι) και ομάδα Ζ (χωρίς βακτήρια στους θηλαίους πόρους, μάρτυρες). Στις δύο θηλές του μαστού των ζώων της ομάδας Ε και στη μία θηλή του μαστού των ζώων της ομάδας Ζ προκλήθηκαν δερματικές αλλοιώσεις, ενώ στις θηλές του μαστού των ζώων της ομάδας ΣΤ δεν έγινε καμία παρέμβαση. Όλες οι προβατίνες της ομάδας Ε εκδήλωσαν κλινική μαστίτιδα 24 ώρες μετά την πρόκληση των αλλοιώσεων, χωρίς να έχει προηγηθεί ενδομαστικός ενοφθαλμισμός μικροβίων. Συνολικά, απομονώθηκαν με μεγαλύτερη συχνότητα βακτήρια χλωρίδας από τα ζώα της ομάδας Ε (71/72 δείγματα), παρά από τα ζώα της ομάδας ΣΤ (36/72 δείγματα) ή Ζ (0/72 δείγματα) (P<0,001). Επιπλέον, η τιμή της βαρύτητας των παθολογοανατομικών ευρημάτων στην ομάδα E ήταν 28, σημαντικά μεγαλύτερη από αυτή στην ομάδα ΣΤ, που ήταν 3, και την Ζ, που ήταν 14 (μέγιστη δυνατή τιμή: 32) (P<0,001). Τέλος, στον τρίτο πειραματισμό, 8 προβατίνες χωρίς βακτήρια στους θηλαίους πόρους τους, χωρίστηκαν σε δύο ομάδες, Η και Θ (n=4). Στα ζώα της ομάδας Η έγινε ενοφθαλμισμός σε ένα θηλαίο πόρο τους με Staphylococcus simulans και στα ζώα της ομάδας Θ απευθείας σε έναν μαστικό αδένα τους. Το στέλεχος του ενοφθαλμισμού (S. simulans), είχε απομονωθεί από το θηλαίο πόρο μίας προβατίνας της ομάδας Ε (2ος πειραματισμός). Οι προβατίνες της ομάδας Η εκδήλωσαν παροδική κλινική και στη συνέχεια υποκλινική μαστίτιδα, ενώ οι προβατίνες της ομάδας Θ εκδήλωσαν βαριά κλινική μαστίτιδα. S. simulans απομονώθηκε από 38/48 δείγματα από την ομάδα Η και 28/48 δείγματα από την ομάδα Θ. Επιπλέον, η τιμή της βαρύτητας των παθολογοανατομικών ευρημάτων στην ομάδα Η ήταν 22 και στην ομάδα Θ ήταν 16 (μέγιστη δυνατή τιμή: 32).Στο κεφάλαιο V, παρουσιάζονται τα ιστολογικά ευρήματα στη θηλή του μαστού αμνάδων. Συγκεκριμένα, εξετάστηκαν 24 θηλές από 12 αμνάδες. Σε έξι θηλές από τρία ζώα, παρατηρήθηκαν συναθροίσεις λεμφοκυττάρων στο όριο μεταξύ θηλαίου πόρου και θηλαίου κόλπου.Στο Κεφάλαιο VI, παρουσιάζονται οι διαφορές στις επιπτώσεις του ενοφθαλμισμού M. haemolytica εντός της θηλής του μαστού δύο διαφορετικών φυλών προβάτων, με σκοπό την αξιολόγηση πιθανών διαφορών στην ευαισθησία μεταξύ των δύο φυλών. Ένα στέλεχος M. haemolytica ενοφθαλμίστηκε στο θηλαίο πόρο προβατίνων Καραγκούνικης φυλής (ομάδα K, n=8) ή φυλής Frisarta (ομάδα Φ, n=8). Οι προβατίνες της ομάδας K δεν εκδήλωσαν κλινική μαστίτιδα, ενώ αντίθετα όλα τα ζώα της ομάδας Φ εκδήλωσαν οξεία κλινική μαστίτιδα (P<0,001). Το βακτήριο απομονώθηκε από 34/48 δείγματα υλικού θηλαίου πόρου και μαστικού εκκρίματος από ζώα της ομάδας K και από 46/46 δείγματα από ζώα της ομάδας Φ (P<0,03 μέχρι και 1 ημέρα μετά τον ενοφθαλμισμό, P>0,2 στη συνέχεια). Η αντίδραση της δοκιμής CMT ήταν ≥"1" σε 17/24 δείγματα μαστικού εκκρίματος από ζώα της ομάδας K και σε 23/23 δείγματα από ζώα της ομάδας Φ. Το βακτήριο απομονώθηκε από 12/24 και 24/24 δείγματα ιστών, αντίστοιχα. Στην ιστοπαθολογική εξέταση, σε δείγματα θηλών από ζώα της ομάδας Κ παρατηρήθηκαν συναθροίσεις λεμφοκυττάρων στο όριο μεταξύ θηλαίου πόρου και θηλαίου κόλπου. Αντίθετα, ανάλογα ευρήματα δεν παρατηρήθηκαν σε δείγματα από θηλές ζώων της ομάδας Φ. Η βαρύτητα των παθολογοανατομικών ευρημάτων στην ομάδα Κ ήταν 41, ενώ στην ομάδα Φ ήταν 93 (μέγιστη δυνατή τιμή: 128).Τα συμπεράσματα που προκύπτουν από τα ευρήματα αυτής της διατριβής είναι τα παρακάτω.(α) Τα λεμφοκύτταρα αποτελούν σημαντικό αμυντικό μηχανισμό της θηλής του μαστού των προβάτων. Οι περιοχές συνάθροισης λεμφοκυττάρων στις θηλές φαίνεται ότι αποτελούν ενεργοποιημένα λεμφοειδή θυλάκια (inducible-lymphoid-follicles). Η παρουσία πλασμοκυττάρων επιβεβαιώνει τη συμμετοχή χυμικής ανοσίας στη θηλή. Η παρατήρηση λεμφοκυττάρων και δομών που έμοιαζαν με λεμφοειδή θυλάκια στις θηλές αμνάδων ενισχύει την άποψη για τον εγγενή χαρακτήρα του αμυντικού αυτού σχηματισμού. Φαίνεται ότι υπάρχουν διαφορές μεταξύ φυλών στην ενεργοποίηση και τη λειτουργία των λεμφοειδών θυλακίων, οι οποίες καταδεικνύουν διαφορές στην ευαισθησία των ζώων μεταξύ τους.(β) Δεν υπάρχουν διαφορές στην παθογόνο δράση μεταξύ στελεχών M. haemolytica που απομονώθηκαν από μαστό προβατίνων ("μαστικά" στελέχη) και στελεχών M. haemolytica που απομονώθηκαν από ανώτερη αναπνευστική οδό αρνιών ("αναπνευστικά" στελέχη). Σε ευνοϊκές συνθήκες, "αναπνευστικά" στελέχη του βακτηρίου μπορούν να διεισδύσουν στο μαστικό αδένα. Τέτοια στελέχη μπορούν να προκαλέσουν ποικίλου βαθμού μαστίτιδα, ανάλογα με την κατάσταση των αμυντικών μηχανισμών της θηλής. Τα ευρήματα αυτά υποστηρίζουν τη θεωρία για μετάδοση του βακτηρίου από το αρνί στη μητέρα του κατά το θηλασμό.(γ) Η βακτηριακή χλωρίδα που βρίσκεται στο θηλαίο πόρο, διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην παθογένεια της ασθένειας. Η βακτηριακή χλωρίδα στη θηλή μπορεί να παράσχει κάποιου βαθμού προστασία κατά των εισβαλλόντων μικροοοργανισμών. Σε περίπτωση μείωσης της αμυντικής ικανότητας της θηλής, η βακτηριακή χλωρίδα της μπορεί να διεισδύσει στο μαστικό παρέγχυμα και να προκαλέσει κλινική μαστίτιδα.Προτάσεις για περαιτέρω ερευνητική δραστηριότητα, ως συνέχεια των ευρημάτων της παρούσας διατριβής, είναι οι παρακάτω.(α) Η αξιοποίηση των αμυντικών μηχανισμών της θηλής, πιθανόν με ανοσοενίσχυση, για την πρόληψη της μαστίτιδας.(β) Η ταυτοποίηση γενετικών διαφορών μεταξύ των ζώων, οι οποίες αφορούν στους αμυντικούς μηχανισμούς της θηλής.