Παράγοντες που επηρεάζουν τη διάρκεια και το ύψος της ιαιμίας και την ικανότητα μετάδοσης του ιού του καταρροϊκού πυρετού στο πρόβατο

Abstract

Bluetongue is an infectious but non-contagious, arthropod-borne viral disease affecting sheep and other domesticated and wild ruminants. The causative agent, bluetongue virus (BTV), is a dsRNA virus and is the prototype species for the genus Orbivirus within the family Reoviridae and transmitted by Culicoides spp. At present, 26 antigenically distinct serotypes have been recognised. BTV infection of sheep can cause a disease which is characterised by pyrexia, haemorrhage, inflammation, ulceration and cyanosis of the mucous membranes lining the oral and nasal cavities, oedema of the head and neck, torticollis, coronitis and laminitis. During the last outbreaks in Greece (1998 – 2001), the disease caused mild clinical signs in sheep. Generally, the duration and severity of the disease varies considerably between different breeds of sheep, viral serotypes/strains and immune response of each animal to viral disease.The objective of this work was to investigate if immunosuppression or immunostimulation could play a role in the pathogenesis of infection, allowing for higher and/or longer viraemia, and greater potential for acquisition of virus by the arthropod vector.Before the main experiment, 3 basic preliminary experiments were done. The first was done in order to set up the experimental model. Sheep of two breeds were inoculated with BTV–9 (GR 199/98RS), subcutaneously and intradermally with 105.75-106 TCID50/ml and the results were evaluated, based on clinical signs, viraemia and necropsy findings. Karagouniko sheep was found more sensitive than Chios and so it was selected for the following experiments. The second study was to develop pharmacological protocol for immunosuppression or immunostimulation in sheep, for which the literature was extremely poor. Cyclophosphamide, used, in one dose of 37.5 mg/kg (intravenously) caused significant leukopaenia and lymphopaenia, which is one of the indicators of immunosuppression. In particular there was a decrease of the T-and B-lymphocyte numbers from day 3 to day 12, and helper and cytotoxic T-lymphocytes from day 3 to day 8. Immunosuppression was maintained at least 8 days after administration of cyclophosphamide, while leukocytes and lymphocyte subsets returned to normal values after 12 days. For the immunostimulation, Freund’s complete adjuvant was selected at a dose of 3 ml per animal, but blood cells were normal. The third study compared six methods for extraction of the viral genome (dsRNA) of BTV, improved protocol denaturation of dsRNA virus and evaluated the design of a quantitative real time RT-PCR (qRT-PCR), using blood samples of experimentally infected sheep. The optimization of extraction methods of BTV and qRT-PCR could be useful in studies of transmission of the disease, the pathogenesis and evaluation of vaccines and the detection and quantification of other dsRNA viruses. From all experiments it was demonstrated that the titre of the virus expressed in EID50/ml, showed a high degree of correlation with copies of BTV dsRNA identified by qRT-PCR. However, this association shows linearity up to 28 days after infection, which makes possible the use of qRT-PCR to determine the concentration of virus in the blood of the animal until this day to avoid the inoculation of ECEs, which is time consuming and laborious process.In the final experiment Karagouniko sheep were immunosuppressed or immunostimulated. The animals were divided into 4 groups, A (subgroups A1 & A2), B, C and D. The animals of subgroups A1 and A2 were treated with cyclophosphamide and animals of group B with Freund’s complete adjuvant, as a non-specific immunostimulant. The animals of subgroup A1 and those of groups B and C were infected with BTV-9, while the animals of group D were environment controls.It was observed that immunosuppressed sheep (subgroup A1) compared to non-immunosuppressed (group C) had earlier clinical signs and viraemia (virus detection by day 3 after infection compared to the 4th) with higher titre (0.73 ± 0.11 log10 ECEs / ml RBCs), from 3rd to 7th days after infection. It is characteristic that virus itself (group C) caused also immunosuppression, since the BTV-infected animals showed significant leukopaenia and lymphopaenia from the first days after infection. Particularly, there was a decrease of helper T-lymphocytes (CD4+) and cytotoxic T-lymphocytes (CD8+) for 3 days, where on day 7th counts had returned to normal. However, immunosuppressed sheep (subgroup A1) had a greater reduction in the number of leukocytes, particularly of B-lymphocytes than non-immunosuppressed (group C). This resulted in a delay by one day, the appearance of antibodies in animals of subgroup A1. By the end of the experiment (93rd day after infection), no significant differences were found in the titre of neutralising antibodies between immunosuppressed and non-immunosuppressed sheep. Therefore, the use of cyclophosphamide in the dose and route of administration, affected mildly only the humoral and cell-mediated immunity of the experimental sheep, the intensity of viraemia and thus the ability of virus transmission, and only for 10 days, so there may contribute to increased transmission of BTV during this period. Finally, the use of Freund’s aduvant (group B) did not provide evidence of immunostimulation, since the immunological tests showed that the values of B- and T- lymphocytes were similar to those of animals in group C. Moreover, the virus was detected by qRT-PCR and isolation in ECEs, as in group C, four days after infection and the titre of virus was similar.

Ο καταρροϊκός πυρετός είναι μία αρθροποδομεταδιδόμενη νόσος, που προσβάλλει το πρόβατο και άλλα κατοικίδια και άγρια μηρυκαστικά. Οφείλεται στον ιό Bluetongue (Bluetongue Virus, BTV), έναν dsRNA ιό, που αποτελεί το πρότυπο είδος του γένους Orbivirus, ανήκει στην οικογένεια Reoviridae, και μεταδίδεται με έντομα του γένους Culicoides. Μέχρι σήμερα ο BTV έχει 26 ορότυπους. Στο πρόβατο προκαλεί νόσο που χαρακτηρίζεται από πυρετό, αιμορραγία, φλεγμονή, εξοίδηση και κυάνωση του στοματικού και ρινικού βλεννογόνου, οίδημα κεφαλής και τραχήλου, στρεψαυχενισμό, ποδοδερματίτιδα και ενδονυχίτιδα. Στην τελευταία επιζωοτία που εμφανίστηκε στην Ελλάδα (1998 – 2001), η νόσος προκάλεσε ήπια συμπτώματα στα πρόβατα. Γενικώς, η διάρκεια και η βαρύτητα της νόσου διαφέρουν ανάλογα με τη φυλή του προβάτου, τον ορότυπο/στέλεχος του ιού και την ανοσολογική αντίδραση του κάθε ζώου.Σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν να διαπιστωθεί κατά πόσο η ανοσοκαταστολή ή η ανοσοενίσχυση θα μπορούσαν να επηρεάσουν την εξέλιξη της λοίμωξης και να παίξουν ρόλο στη μετάδοση του ιού, αυξάνοντας τον τίτλο του λοιμογόνου ιού στο αίμα, την παραμονή του στο ζώο και τη μετάδοσή του με τους ξενιστές.Πριν το κυρίως πείραμα προηγήθηκαν τρεις απαραίτητες βασικές προκαταρκτικές μελέτες. Η πρώτη είχε ως σκοπό τη διαμόρφωση του πειραματικού προτύπου μόλυνσης. Χρησιμοποιήθηκαν πρόβατα δύο ελληνικών φυλών, Καραγκούνικης και Χίου, που μολύνθηκαν με τον ορότυπο BTV–9 (GR 199/98RS) υποδόρια και ενδοδερμικά με 105,75-106 TCID50/ml, και τα αποτελέσματα αξιολογήθηκαν βάσει των συμπτωμάτων, της ιαιμίας και των νεκροτομικών αλλοιώσεων. Το πρόβατο της Καραγκούνικης φυλής ήταν πιο ευαίσθητο από εκείνο της Χίου κι έτσι επιλέχθηκε για τα επόμενα πειράματα. Η δεύτερη μελέτη αφορούσε στη διαμόρφωση της μεθόδου ανοσοκατατολής ή ανοσοενίσχυσης στο πρόβατο, για τα οποία η βιβλιογραφία είναι εξαιρετικά φτωχή. Επιλέχθηκε η χρήση κυκλοφωσφαμίδης για την πρόκληση ανοσοκαταστολής, της οποίας μία δόση των 37,5 mg/kg (ενδοφλεβίως) βρέθηκε ότι προκαλεί σημαντική λευκοπενία και λεμφοκυτταροπενία, που αποτελούν δείκτες ανοσοκαταστολής. Συγκεκριμένα, υπήρξε μείωση των Τ- και Β- λεμφοκυττάρων από την 3η έως τη 12η ημέρα, και των βοηθητικών και κυτταροτοξικών Τ-λεμφοκυττάρων από την 3η έως την 8η ημέρα. Η ανοσοκαταστολή διατηρήθηκε τουλάχιστον 8 ημέρες μετά την έγχυση της φαρμακευτικής ουσίας, ενώ τα λευκοκύτταρα και οι λεμφοκυτταρικοί υποπληθυσμοί επανήλθαν στις φυσιολογικές τους τιμές μετά τη 12η ημέρα. Για την ανοσοενίσχυση επιλέχθηκε το πλήρες ανοσοενισχυτικό του Freund, στη δόση των 3 ml ανά ζώο, που όμως είχε ως αποτέλεσμα φυσιολογικές τιμές κυττάρων του αίματος. Στην τρίτη μελέτη συγκρίθηκαν έξι μέθοδοι εκχύλισης του ιικού γενώματος (dsRNA) του BTV, βελτιώθηκε το πρωτόκολλο αποδιάταξης του dsRNA του ιού και αξιολογήθηκε ο σχεδιασμός μιας ποσοτικής πραγματικού χρόνου RT-PCR (qRT-PCR), χρησιμοποιώντας δείγματα αίματος πειραματικά μολυσμένων προβάτων. Η βελτιστοποίηση των μεθόδων εκχύλισης του BTV και της qRT-PCR θα μπορούσαν να χρησιμεύσουν στις μελέτες της μετάδοσης της νόσου, στην παθογένεια και στην αξιολόγηση εμβολίων, καθώς και στην ανίχνευση και ποσοτικοποίηση και άλλων dsRNA ιών. Από το σύνολο των πειραματισμών αποδείχθηκε ότι ο τίτλος του ιού, εκφρασμένος σε EID50/ml, εμφάνισε υψηλό βαθμό συσχέτισης με τα dsRNA αντίγραφα του BTV που προσδιορίστηκαν με qRT-PCR. Ωστόσο, η συσχέτιση αυτή παρουσιάζει γραμμικότητα μέχρι την 28η ημέρα μετά τη μόλυνση, γεγονός που καθιστά δυνατή τη χρήση της qRT-PCR για τον προσδιορισμό της συγκέντρωσης του ιού στο αίμα του ζώου μέχρι την ημέρα αυτή, ώστε να αποφευχθεί ο ενοφθαλμισμός εμβρυοφόρων αυγών, που είναι χρονοβόρος και επίπονη διαδικασία.Στο τελικό πείραμα έγινε ανοσοκαταστολή ή ανοσοδιέγερση Καραγκούνικων προβάτων. Τα πειραματόζωα χωρίστηκαν σε 4 ομάδες, τις Α (Α1 & Α2), Β, Γ και Δ. Στα ζώα των υποομάδων Α1 και Α2 χορηγήθηκε κυκλοφωσφαμίδη και στα ζώα της ομάδας Β το πλήρες ανοσοενισχυτικό του Freund. Τα ζώα της υποομάδας Α1 και αυτά των ομάδων Β και Γ μολύνθηκαν με τον BTV–9, ενώ τα ζώα της ομάδας Δ χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες περιβάλλοντος. Παρατηρήθηκε ότι τα ανοσοκατεσταλμένα πρόβατα (υποομάδα Α1), σε σχέση με τα μη ανοσοκατεσταλμένα (ομάδα Γ), εμφάνισαν νωρίτερα πυρετό και ιαιμία (ανίχνευση ιού από την 3η ημέρα μετά τη μόλυνση έναντι της 4ης), με υψηλότερο τίτλο ιού (0,73±0,11 log10 ECEs/ml ερυθροκυττάρων) από την 3η έως την 7η ημέρα μετά τη μόλυνση. Χαρακτηριστικό είναι ότι ανοσοκαταστολή προκάλεσε και ο ιός, αφού τα μολυσμένα με BTV ζώα παρουσίασαν σημαντική λευκοπενία και λεμφοκυτταροπενία από την 1η ημέρα μετά τη μόλυνση. Συγκεκριμένα, υπήρξε μείωση των βοηθητικών Τ-λεμφοκυττάρων (CD4+) και των κυτταροτοξικών Τ-λεμφοκυττάρων (CD8+) που διήρκησε 3 ημέρες περίπου, ενώ την 7η ημέρα επανήλθαν στις φυσιολογικές τους τιμές.Ωστόσο τα ανοσοκατεσταλμένα πρόβατα (υποομάδα Α1) είχαν μεγαλύτερη μείωση του αριθμού των λευκοκυττάρων και ιδιαίτερα των Β-λεμφοκυττάρων σε σχέση με τα μη ανοσοκατεσταλμένα (ομάδα Γ). Αυτό είχε ως αποτέλεσμα την καθυστέρηση, κατά μία ημέρα, της εμφάνισης αντισωμάτων στα ζώα της υποομάδας Α1. Εντούτοις, δεν διαπιστώθηκαν στατιστικά σημαντικές διαφορές στους τίτλους των εξουδετερωτικών αντισωμάτων μεταξύ ανοσοκατεσταλμένων και μη προβάτων μέχρι το τέλος του πειράματος (93η ημέρα μετά τη μόλυνση). Επομένως, η κυκλοφωσφαμίδη στη δόση και στην οδό χορήγησης που χρησιμοποιήθηκε επηρέασε σε σχετικά μικρό βαθμό τη χυμική και την κυτταρική ανοσία του προβάτου, την ένταση της ιαιμίας και κατ’ επέκταση την ικανότητα μετάδοσης του ιού, αλλά μόνο για 10 ημέρες, επομένως ελάχιστα ή οριακά θα μπορούσε να συμβάλλει σε αυξημένη μετάδοση του ιού. Τέλος, σχετικά με την ομάδα Β (πλήρες ανοσοενισχυτικό του Freund) δεν υπήρξαν ενδείξεις ανοσοενίσχυσης, αφού οι ανοσολογικές εξετάσεις των ζώων έδειξαν ότι οι τιμές των Β- και Τ- λεμφοκυττάρων ήταν παρόμοιες με εκείνες των ζώων της ομάδας Γ. Επίσης ο ιός ανιχνεύτηκε με qRT-PCR και απομονώθηκε σε εμβρυοφόρα αυγά, όπως και στην ομάδα Γ, τέσσερις ημέρες μετά τη μόλυνση και οι τίτλοι του ιού ήταν παρόμοιοι.