Η ανίχνευση της έκφρασης των γονιδίων RKIP και RAF (A, B και C) σε ασθενείς με καρκίνο ουροδόχου κύστης

Abstract

RKIP has been shown to regulate the RAS-RAF-MEK-ERK kinase cascade acting as modulator of apoptosis and metastasis in prostate cancer. Our goal was to examine the expression of the RAF (A-RAF, B-RAF and RAF-1) and RKIP genes in urinary bladder cancer. Microarray analysis and qPCR was employed to investigate the expression of RAF and RKIP, in 30 patients with transitional cell carcinoma (TCC) of the urinary bladder vs. the corresponding levels of adjacent normal tissue. Computational analysis was also performed on Gene Expression Omnibus (GEO) datasets, to unravel differences in the expression of RAF or RKIP between tumor and control samples, and between superficial and muscle invasive tumors. Microarray analysis revealed >2-fold expression of BRAF and RKIP in T2, T3, grade III tumors vs. controls. B-RAF over-expression was verified by qPCR in pT1, grade III tumors vs. their normal counterparts (p=0.016). qPCR revealed a significant RKIP reduction in TCC vs. normal tissue (p=0.002 and p<0.001 for T1, grade II and Ta-T1, grade III, respectively); All RAF genes were positively correlated among each other (A-RAF/B-RAF, p=0.003; A-RAF/RAF-1, p<0.001; B-RAF/RAF-1, p=0.050), whereas B-RAF was negatively correlated with RKIP in TCC (p=0.050). Further computational analysis revealed different expression profiles for the genes of interest, among muscle invasive carcinomas, superficial TCCs, cystectomy specimens and normal tissue. The reduced RKIP mRNA levels in TCC and the elevated levels of B-RAF in pT1, grade III tumors vs. normal tissue, corroborate that these genes are involved in the pathogenesis of urinary bladder cancer.

Το RKIP έχει δειχθεί ότι ρυθμίζει τον καταρράκτη φωσφορυλίωσης της ΜΑΡΡ κινάσης, RAS-RAF-MEK-ERK, δρώντας ως διαμορφωτής της απόπτωσης και της μετάστασης στον καρκίνο του προστάτη. Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής είναι η μελέτη της έκφρασης των γονιδίων RAF (A-RAF, B-RAF και C-RAF ή RAF-1) και RKIP σε ασθενείς με ουροθηλιακό καρκίνο ουροδόχου κύστεως. Για την παρούσα μελέτη χρησιμοποιήθηκαν δείγματα από 30 ασθενείς με καρκίνο μεταβατικού επιθηλίου ουροδόχου κύστεως (TCC) σε σύγκριση με 30 δείγματα από τον παρακείμενο φυσιολογικό ιστό, όπου και μελετήθηκαν με τη μέθοδο της Microarray ανάλυσης και της qPCR που πραγματοποιήθηκε με σκοπό την ανίχνευση των επιπέδων έκφρασης των γονιδίων RAF και RKIP στα δείγματα αυτά. Επίσης πραγματοποιήθηκε Computational ανάλυση με τα πακέτα δεδομένων Gene Expression Omnibus (GEO) datasets, με σκοπό να διαλευκανθούν οι διαφορές της έκφρασης των RAF ή RKIP γονιδίων μεταξύ των καρκινικών δειγμάτων και των controls καθώς επίσης και μεταξύ των επιφανειακών όγκων και των μυοδιηθητικών όγκων. Τα αποτελέσματα από τη Microarray ανάλυση αποκάλυψαν υπερέκφραση (>2-fold), της έκφρασης των γονιδίων BRAF και RKIP σε όγκους T2, T3, grade III σε σύγκριση με τα controls. Η υπερέκφραση του B-RAF επαληθεύτηκε περαιτέρω με τη μέθοδο της qPCR σε όγκους pT1, grade III σε σχέση με τα αντίστοιχα φυσιολογικά δείγματα (p=0.016). Με την qPCR παρατηρήθηκε σημαντική μείωση της έκφρασης του RKIP στα δείγματα TCC σε σχέση με αυτά του φυσιολογικού ιστού (p=0.002 και p<0.001 για όγκους T1, grade II και Ta-T1, grade III, αντίστοιχα). Όσον αφορά τις συσχετίσεις μεταξύ των γονιδίων RAF και RKIP, όλα τα RAF γονίδια παρουσίασαν θετικές συσχετίσεις μεταξύ τους (A-RAF/B-RAF με p=0.003, ARAF/ RAF-1με p<0.001, B-RAF/RAF-1με p=0.050), ενώ το B-RAF παρουσίασε αρνητική συσχέτιση με το RKIP στα δείγματα TCC (p=0.050). Ωστόσο με την πραγματοποίηση της Computational ανάλυσης παρατηρήθηκαν τα διαφορετικά εκφραστικά προφίλ των γονιδίων του ενδιαφέροντος μεταξύ, μυοδιηθητικών όγκων, επιφανειακών όγκων του ουροθηλίου της ουροδόχου κύστεως, δειγμάτων κυστεκτομής και φυσιολογικού ιστού. Συνοπτικά λοιπόν, η μείωση των επιπέδων έκφρασης του RKIP mRNA σε καρκινικά δείγματα μεταβατικού επιθηλίου ουροδόχου κύστης και τα αυξημένα επίπεδα του B-RAF mRNA σε όγκους pT1, grade III σε σχέση με αυτά του φυσιολογικού ιστού παρέχουν ενδεικτικά στοιχεία ότι αυτά τα γονίδια εμπλέκονται στην παθογένεια του ουροθηλιακού καρκίνου της ουροδόχου κύστης