Επίδραση φαρμάκων στη στάσιμη φάση του κυτταρικού κύκλου του σακχαρομύκητα

Abstract

The wide use of the unicellurar eukaryote Saccharomyces cerevisiae as an established experimental organism for the study of the adaptive and protective mechanisms underlying the cellular response to stressful stimuli is attributed to the presence of evolutionary conserved physiological, biochemical, cellular and molecular processes that govern the cellular stress response. The aim of this study was to investigate the effects of pharmacologically active substances on the heat shock response (HS) in S. cerevisiae and the possible involvement of key molecular factors such as the heat shock proteins (hsp’s). The experimental approach was based on the administration of the active substances in yeast cultures either during all phases (chronic administration) or during the post-logarithmic phase of growth (acute administration) and the subsequent exposure to potentially lethal HS. The active substances included mainly inflammatory/antinflammatory agents and the hormone thyroxine. The cellular stress response was evaluated by the determination of (a) yeast survival using microscopy, (b) the ability of yeast cells to proliferate after HS and (c) the key stress response molecular factors hsp60, hsp90 and hsp104. In many cases, the molecular techniques were modified so as to ensure the development of reliable methodology for the experimental investigation of the response. The results demonstrated that histamine induces a biphasic alteration of the resistant phenotype only upon acute administration and tends to induce hsp expression in the thermosensitive yeast cultures. Alteration of histamine effects was observed upon the pharmacological modification of the microenvironment with thyroxine, which seems to induce thermotolerance via non-nuclear-mediated mechanisms. The response to the Η1 antagonist dimethindene was dependent on the form of the compound that was administered. The Η2 antagonist ranitidine did not induce thermotolerance, in contrast to the Η3 and Η4 ligands, thioperamide and JNJ7777120, respectively, which resulted in a biphasic, most probably hsp-mediated acquisition of thermotolerance. The results strengthen the contribution of the immunomodulatory/inflammatory and hormonal pathways in the mechanisms underlying the cellular stress response. The data cannot be applied directly to higher mammalian processes. However, based on many homologous evolutionary conserved cellular processes between S. cerevisiae and higher eukaryotes and the reliability of the experimental model in cellular stress response research, they provide first indications for the molecular actions of these agents that deserve re-evaluation of their effects under various (patho)physiological conditions.

Η ευρεία χρήση του μονοκυττάριου ευκαρυωτικού οργανισμού Saccharomyces cerevisiae ως πειραματικού προτύπου για τη μελέτη της προσαρμοστικής και προστατευτικής απάντησης των κυττάρων σε στρεσσογόνα ερεθίσματα οφείλεται κυρίως στην παρουσία εξελικτικώς συντηρητικών φυσιολογικών, βιοχημικών, κυτταρικών και μοριακών διεργασιών που διέπουν την κυτταρική απάντηση στο stress. Σκοπός της διατριβής ήταν η διερεύνηση της επίδρασης φαρμακολογικά δραστικών παραγόντων κατά την απάντηση του S. cerevisiae στο θερμικό shock (HS), και της πιθανής συμμετοχής μοριακών παραγόντων όπως οι πρωτεΐνες του θερμικού shock (hsp’s). Η πειραματική προσέγγιση αφορούσε χορήγηση των δραστικών παραγόντων σε καλλιέργειες του σακχαρομύκητα είτε καθόλες τις φάσεις ανάπτυξης (χρόνια χορήγηση), είτε κατά τη μεταλογαριθμική φάση της ανάπτυξης (οξεία χορήγηση) και επακόλουθη έκθεση σε εν δυνάμει θανατηφόρο HS. Οι δραστικές ουσίες που χρησιμοποιήθηκαν περιελάμβαναν κυρίως φλεγμονώδεις/αντιφλεγμονώδεις παράγοντες και την ορμόνη θυροξίνη. Η απάντηση των κυττάρων στο stress αξιολογήθηκε με τον προσδιορισμό (α) της επιβίωσης με τη χρήση μικροσκοπίου, (β) της δυνατότητας πολλαπλασιασμού των κυττάρων μετά το HS και (γ) των μοριακών παραγόντων της κυτταρικής απάντησης στο stress hsp60, hsp90 και hsp104. Σε πολλές περιπτώσεις, οι μοριακές τεχνικές τροποποιήθηκαν με σκοπό την ανάπτυξη αξιόπιστης μεθοδολογίας για την πειραματική προσέγγιση του φαινομένου. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η ισταμίνη προκαλεί διφασική μεταβολή του θερμοανθεκτικού φαινοτύπου μόνο κατά την οξεία χορήγησή της και τάση επαγωγής των hsp’s σε καλλιέργειες όπου δεν παρατηρήθηκε αύξηση της θερμοανθεκτικότητας σε κυτταρικό επίπεδο. Η δράση της ισταμίνης μπορεί να μεταβληθεί σε τροποποιημένο υπόστρωμα παρουσία θυροξίνης, η οποία φαίνεται ότι επάγει τη θερμοανθεκτικότητα μέσω συμμετοχής μη πυρηνικών μηχανισμών. Η απάντηση στον ανταγωνιστή των Η1 υποδοχέων διμεθινδένη ήταν εξαρτώμενη από τη μορφή του άλατος της ουσίας που μελετήθηκε. Ο ανταγωνιστής των Η2 υποδοχέων ρανιτιδίνη δεν προκάλεσε αύξηση της θερμοανθεκτικότητας, σε αντίθεση με τους ανταγωνιστές των Η3 και Η4 υποδοχέων, θειοπεραμίδη και JNJ7777120, οι οποίοι προκάλεσαν διφασική απάντηση στην επιβίωση του σακχαρομύκητα και αύξηση της έκφρασης των hsp’s κατά την εμφάνιση του ανθεκτικού φαινοτύπου. Τα αποτελέσματα ενισχύουν τη συμμετοχή ανοσορυθμιστικών/φλεγμονωδών και ορμονικών μονοπατιών στους μηχανισμούς απάντησης του κυττάρου στο stress. Τα δεδομένα δεν μεταφέρονται απευθείας στα ανώτερα θηλαστικά. Λόγω της ομολογίας εξελικτικώς συντηρητικών διεργασιών μεταξύ του S. cerevisiae και των ανώτερων ευκαρυωτικών κυττάρων και της αξιοπιστίας του πειραματικού προτύπου κατά τη διερεύνηση της κυτταρικής απάντησης στο stress, παρέχουν πρωτότυπες ενδείξεις για τη μοριακή δράση των ουσιών αυτών, οι οποίες υποστηρίζουν την ανάγκη επαναξιολόγησης της επίδρασής τους σε φυσιολογικές και παθολογικές καταστάσεις.