Development of optical and electrochemical biosensors based on Au MNPs and CdSe/ZnS quantum dots

Abstract

The combination of biotechnology and nanotechnology has led to a tremendous development of hybrid nanomaterials that combine the unique recognition catalytic and inhibition properties of biomolecules such as DNA enzyme antibody etc. with the unique electronic photonic and catalytic properties of the nanoparticles, nanowires or nanorods. Biosensors are fast and selective detection systems of low operational cost with potential applications in areas where rapid detection high sensitivity and specificity are important. However, their use is not as wide spread as expected. The reasons focus mainly on the poor biosensor stability during storage or continuous operation as well as the reproducibility of their construction. The stability of a biosensor depends on the life time and the rate of deactivation of the biomolecule used. The past decade nanomaterials have been proposed for using in biosensing systems due to the fact that they can act as immobilizing platforms for the biomolecules and thus improve their stability. The purpose of the present work was to develop new nanomaterial based biosensor systems that would take advantage of the excellent properties they possess in offering sensitive and reliable optical and electrochemical transducing systems and biomolecule immobilization matrices. The excellent photoluminescent properties of semiconductor CdSe/ZnS core/shell quantum dots (QDs) have been used in order to construct detection systems for mutations in oligonucleotides. The probe oligonucleotide has been conjugated to the surface of the QDs and their photoluminescent signal has been followed upon conjugation with the target oligonucleotide and with mismatched oligonucleotides. The same semiconductor core/shell CdSe/ZnS QDs have been used for the construction of a new optical biosensor system for the detection of the enzymatic activity of acetylcholinesterase (AChE). The QDs have been conjugated to AChE and further entrapped into biosilica. The QDs offer an excellent optical transduction platform for the development of the enzymatic reaction and prove to be suitable for monitoring low substrate concentrations in solution. The same biomolecules (oligonucleotides and AChE) have been used in the construction of biosensors based on the excellent optical and electrochemical properties of colloidal gold nanoparticles (Au NPs). The conjugation of Au NPs to probe oligonucleotides and hybridization with target was the basis for obtaining a simple and easy to use optical method in detecting hybridization events. Finally, Au NPs have been used in the construction of an amperometnc biosensor. The proposed biosensor system was found able to provide electron transfer from the enzyme to the electrode sensitive to very small substrate concentrations being very stable over time. It is also shown that the immobilization of the AChE onto the Au doped biosilica nano composite provides better signal mediation and significant enzyme stabilization when compared with the existing AChE biosensors.

Ο συνδυασμός της βιοτεχνολογίας και της νανοτεχνολογίας έχει οδηγήσει σε θεαματική ανάπτυξη υβριδικών νανουλικών που συνδυάζουν τις μοναδικές ιδιότητες χημικής αναγνώρισης και κατάλυσης βιομορίων όπως τα DNA ένζυμα αντισώματα με τις μοναδικές ηλεκτρονικές καταλυτικές και οπτικές ιδιότητες των νανοσωματιδίων, νανοκαλωδίων και νανοράβδων. Η σύζευξη των βιομορίων και των νανουλικών δίνει τη δυνατότητα πολλών εφαρμογών στον τομέα της νάνο βιοτεχνολογίας. Οι βιοαισθητήρες αποτελούν γρήγορα και ευαίσθητα συστήματα ανίχνευσης με μικρό κόστος λειτουργίας που θα μπορούσαν να βρουν εφαρμογή σε τομείς όπου η γρήγορη ανίχνευση, η υψηλή ευαισθησία και επιλεκτικότητα είναι σημαντικές. Ωστόσο, η χρήση τους δεν είναι ακόμα ευρέως διαδεδομένη. Υπάρχουν πολλοί λόγοι για αυτό με κυριότερους τη μικρή σταθερότητα κατά την αποθήκευση και λειτουργία, καθώς επίσης και τη μικρή αναπαραγωγιμότητα της κατασκευής τους. Η σταθερότητα των βιοαισθητήρων επηρεάζει περισσότερο τα αναλυτικά χαρακτηριστικά τους. Η σταθερότητα εξαρτάται από τον χρόνο ζωής και το ρυθμό απενεργοποίησης του βιομορίου που χρησιμοποιείται. Την τελευταία δεκαετία τα νανουλικά χρησιμοποιούνται σε συστήματα βιοαισθητήρων λόγω του ότι αποτελούν υλικά κατάλληλα για την ακινητοποίηση των βιομορίων βελτιώνοντας τη σταθερότητα τους. Σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν η ανάπτυξη νέων συστημάτων βιοαισθητήρων βασισμένων σε νανουλικά τα οποία λόγω των εξαιρετικών ιδιοτήτων τους αποτελούν ευαίσθητους και αξιόπιστους οπτικούς ή ηλεκτροχημικούς μεταλλάκτες σήματος καθώς και υλικά ακινητοποίησης των βιομορίων . Η φωταύγεια των ημιαγώγιμων κβαντικών τέλειων (QDs) CdSe/ZnS αποτελεί τη βάση για την κατασκευή συστημάτων ανίχνευσης μεταλλάξεων στις αλυσίδες ολιγονουκλεοτιδίων. Το ολιγονουκλεοτίδιο ανίχνευσης συνδέθηκε στην επιφάνεια των κβαντικών τελειών και μετρήθηκε η φωταύγεια κατά τη σύζευξη με το συμπληρωματικό ολιγονουκλεοτίδιο στόχο και με μη συμπληρωματικά ολιγονουκλεοτίδια. Οι ίδιες ημιαγώγιμες κβαντικές τέλειες CdSe/ZnS χρησιμοποιήθηκαν για την κατασκευή ενός νέου οπτικού βιοαισθητήρα για την ανίχνευση της ενζυμικής δραστικότητας της ακετυλοχολινεστεράσης (AChE). Οι κβαντικές τελείες συνδέθηκαν σε AChE και στη συνέχεια παγιδεύτηκαν σε βιομιμητικά παραγόμενο διοξείδιο του πυριτίου για την περαιτέρω σταθεροποίηση του ενζύμου. Η υψηλή φωταύγεια των κβαντικών τελειών αποτελεί εξαιρετικό τρόπο μετάλλαξης του σήματος κατά την ενζυμική αντίδραση και αποδεικνύεται κατάλληλη για την παρακολούθηση χαμηλών συγκεντρώσεων υποστρώματος στο διάλυμα. Τα ίδια βιομόρια (ολιγονουκλεότιδια κα το ένζυμο ακετυλοχολινεστεράση) χρησιμοποιήθηκαν στην κατασκευή βιοαισθητήρων βασισμένων στις εξαιρετικές οπτικές και ηλεκτροχημικές ιδιότητες κολλοειδών νανοσωματιδίων χρυσού (Au NPs). Στην κατασκευή των οπτικών βιοαισθητήρων χρησιμοποιήθηκαν νανοσωματίδια χρυσού διαφορετικού μεγέθους εκμεταλλευόμενοι τον επιφανειακό συντονισμό πλάσματος των σωματιδίων που εξαρτάται από το μέγεθος και την απόσταση μεταξύ τους. Τέλος, τα νανοσωματίδια χρυσού χρησιμοποιήθηκαν σε ένα αμπερομετρικό βιοαισθητήρα. Το ένζυμο συνδέθηκε στην επιφάνεια των Au NPs και στη συνέχεια ακολούθησε παγίδευση σε βιομιμητικά παραγόμενο διοξείδιο του πυριτίου για την περαιτέρω σταθεροποίηση. Ο προτεινόμενος βιοαισθητήρας παρείχε εξαιρετική μεταφορά ηλεκτρονίων από το ένζυμο στο ηλεκτρόδιο μεγάλη ευαισθησία σε μικρές συγκεντρώσεις υποστρώματος και μεγάλη σταθερότητα στο χρόνο. Επίσης αποδείχθηκε ότι η ακινητοποίηση της AChE στις δομές Au βιομιμητικά παραγομένου διοξειδίου του πυριτίου παρέχει τόσο μεταφορά του σήματος αλλά και σημαντική σταθεροποίηση του ενζύμου σε σχέση με τους ήδη υπάρχοντες βιοαισθητήρες.