Μελέτη της πιθανής μετάδοσης των σπογγόμορφων εγκεφαλοπαθειών σε νέα είδη και δημιουργία νέων πειραματικών μοντέλων για την ανάπτυξη μεθόδων διάγνωσης και θεραπείας των εν λόγω παθήσεων

Abstract

In transmissible spongiform encephalopathies (TSEs), a group of fatal neurodegenerative disorders affecting many species, the key event in disease pathogenesis is the accumulation of an abnormal conformational isoform (PrPSc) of the host-encoded cellular prion protein (PrPC). While the precise mechanism of the PrPC to PrPSc conversion is not understood, it is clear that host PrPC expression is a prerequisite for effective infectious prion propagation. Although there have been many studies on TSEs in mammalian species, little is known about TSE pathogenesis in fish. The current study aimed not only at evaluating the possible transmission of prion diseases to fish species, but also at gaining further understanding on the nature and the role of PrP proteins in fish. Thus, some general conclusions could be drawn concerning the function of prion proteins in health and disease. Molecular analysis techniques and the application of anti-fish PrP specific antibodies, suggested that these proteins become C-terminally glycosylated by the addition of N-acetylglusamine groups, whereas they display a similar to the mammalian prion proteins tissue distribution, exhibiting the highest expression levels in the CNS. These similarities, in combination with the conserved prion protein motifs of primary and secondary structure, render these proteins useful models for studying their orthologues’ function in mammals, whereas at the same time they raise concerns about a possible transmission of prion diseases to fish. In order to investigate such a possibility, we employed both in vitro and in vivo approaches. Our in vitro system included the introduction of the proteins SaurPrP-1 (Sparus aurata), ZebPrP-1 and ZebPrP-2 (Danio rerio) into mouse neuroblastoma cells (N2a), infected with the 22L mouse-adapted scrapie strain. Despite the fact that the fish PrPs followed common biosynthetic pathways with their mammalian relatives, they didn’t display resistance to proteinase K treatment. This finding suggests that this specific scrapie strain is not capable of converting the fish PrP proteins into a potentially pathological isoform. For the in vivo study, we orally challenged sea bass and sea bream with BSE and scrapie infectious brain material. Fish tissue samples were tested at regular time points post inoculation by a variety of techniques. Despite the fact that none of the TSE-inoculated groups developed clinical prion disease, the brains of TSE-fed fish sampled two years after challenge did show signs of neurodegeneration and accumulation of deposits that reacted positively with antibodies raised against sea bream PrP. Remarkably, the deposits developed much more rapidly and extensively in fish inoculated with BSE-infected material than in those challenged with the scrapie-infected brain homogenate, with numerous deposits being proteinase K-resistant. These plaque-like aggregates exhibited congophilia and birefringence in polarized light, consistent with an amyloid-like component. The neurodegeneration and abnormal deposition in the brains of fish challenged with prion, especially BSE, raises concerns about the potential risk to public health. As fish aquaculture is an economically important industry providing high protein nutrition for humans and other mammalian species, the prospect of farmed fish being contaminated with infectious mammalian PrPSc is alarming and requires further evaluation.

Στις Μεταδιδόμενες Σπογγώδεις Εγκεφαλοπάθειες, οι οποίες αποτελούν μία ομάδα ανίατων νευροεκφυλιστικών νόσων που προσβάλλουν πολλά είδη, καθοριστικό ρόλο κατά την παθογένεση διαδραματίζει η συσσώρευση της μη φυσιολογικής στερεοχημικής ισομορφής (PrPSc), μίας φυσιολογικής ενδογενούς πρωτεΐνης (PrPC). Παρά το γεγονός ότι ο ακριβής μηχανισμός της μετατροπής της PrPC προς PrPSc δεν είναι γνωστός, θεωρείται δεδομένο ότι η έκφραση της PrPC στον ξενιστή είναι απαραίτητη προϋπόθεση για την εκδήλωση μόλυνσης prion. Μολονότι έχουν γίνει πάρα πολλές μελέτες όσον αφορά στις Σπογγώδεις Εγκεφαλοπάθειες στα θηλαστικά, η υπάρχουσα γνώση σχετικά με την παθογένεση prion στους ιχθύες είναι περιορισμένη. Στο πλαίσιο της παρούσας διατριβής επιδιώχθηκε η μελέτη της πιθανής μετάδοσης των νόσων prion σε είδη ιχθυών, καθώς και η καλύτερη κατανόηση της φύσης και του ρόλου των PrP πρωτεϊνών στους ιχθύες, προκειμένου να εξαχθούν συμπεράσματα σχετικά με τη γενικότερη δράση των prion πρωτεϊνών σε φυσιολογικές και παθολογικές καταστάσεις. Με την εφαρμογή μοριακών τεχνικών ανάλυσης και τη χρήση αντισωμάτων εκλεκτικών για τις PrP πρωτεΐνες ιχθύων, διαπιστώθηκε ότι οι πρωτεΐνες αυτές, φέρουν όπως και στα θηλαστικά ομάδες Ν-ακετυλογλυκοζαμίνης στο καρβοξυτελικό άκρο, ενώ παράλληλα παρουσιάζουν όμοια ιστική κατανομή, εμφανίζοντας υψηλότερα επίπεδα στο ΚΝΣ. Οι άνωθεν ομοιότητες σε συνδυασμό με τα διατηρημένα μοτίβα πρωτοταγούς και δευτεροταγούς διαμόρφωσης, χαρακτηριστικά των πρωτεϊνών prion, καταρχήν καθιστούν τις πρωτεΐνες αυτές χρήσιμα μοντέλα για τη μελέτη της δράσης των ορθόλογων μορίων τους στα θηλαστικά, και κατά δεύτερον διεγείρουν ανησυχίες σχετικά με μία πιθανή μετάδοση των νόσων prion στους ιχθύες. Προκειμένου να διερευνηθεί μία τέτοια πιθανότητα, ακολουθήθηκαν τόσο in vitro, όσο και in vivo προσεγγίσεις. Το in vitro σύστημα μελέτης περιέλαμβανε την εισαγωγή των πρωτεϊνών SaurPrP-1 (Sparus aurata), ZebPrP-1 και ZebPrP-2 (Danio rerio) σε κύτταρα νευροβλαστώματος μυός (Ν2a), μολυσμένα με το στέλεχος scrapie μυός 22L. Παρά το γεγονός ότι οι εξωγενείς PrP πρωτεΐνες των ιχθύων φαίνεται πως ακολούθησαν κοινά βιοσυνθετικά μονοπάτια με τις αντίστοιχες των θηλαστικών, δεν εμφάνισαν ανθεκτικότητα στην κατεργασία με πρωτεϊνάση Κ. Η παρατήρηση αυτή οδηγεί στο συμπέρασμα ότι το συγκεκριμένο στέλεχος scrapie δεν είναι σε θέση να μετατρέψει τις PrP πρωτεΐνες των ιχθύων που χρησιμοποιήθηκαν στη μελέτη προς κάποια δυνητικά παθολογική ισομορφή. Κατά την in vivo μελέτη, χορηγήθηκε από του στόματος μολυσματικό εγκεφαλικό υλικό BSE και scrapie σε λαβράκια και τσιπούρες, δείγματα των οποίων αναλύθηκαν ανά τακτά χρονικά διαστήματα με ένα πλήθος τεχνικών. Παρά το γεγονός ότι καμία από τις ομάδες των ιχθύων δεν ανέπτυξε κλινική νόσο, οι εγκέφαλοι από τσιπούρες που έλαβαν TSE ομογενοποίημα, δύο χρόνια μετά το πέρας του ενοφθαλμισμού παρουσίασαν ίχνη νευροεκφύλισης και συσσώρευσης εναποθέσεων. Ειδικά οι εναποθέσεις στον εγκέφαλο ιχθύων που έλαβαν BSE εγκεφαλικό ιστό, παρουσίασαν μερική ανθεκτικότητα στην κατεργασία με ΡΚ, κονγκοφιλία και διπλοθλαστικότητα στο πολωμένο φως, στοιχείο που συνάδει με την ύπαρξη αμυλοειδούς δομής. Η παρουσία νευροεκφύλισης και μη φυσιολογικής εναπόθεσης στους εγκεφάλους των ιχθύων που έλαβαν TSE μολυσματικό υλικό, εγείρει ορισμένους προβληματισμούς για τη δημόσια υγεία. Καθώς η ιχθυοκαλλιέργεια αποτελεί μία οικονομικά σημαντική βιομηχανία, παρέχοντας προϊόντα υψηλής διατροφικής αξίας για τον άνθρωπο και άλλα θηλαστικά, το ενδεχόμενο πιθανής μόλυνσης των καλλιεργούμενων ιχθύων με μολυσματική PrPSc ζωικής προέλευσης αποτελούν ιδιαίτερα ανησυχητικά ζητήματα, τα οποία χρήζουν περαιτέρω μελέτης.