Προσδιορισμός του νευροληπτικού φαρμάκου κλοζαπίνη και του κύριου μεταβολίτη αυτής σε βιολογικά υγρά με φασματομετρία μάζας: εφαρμογές στην κλινική και δικαστική τοξικολογία

Abstract

Clozapine (CLZ) is classified as an atypical antipsychotic drug due to its complex pharmacologic properties and different effects that produce comparing to those exhibited by more typical antipsychotics. CLZ is efficacious for the treatment of patients with schizophrenia who fail to show an acceptable response to standard antipsychotic drugs. However, the usage of CLZ has been restricted as a consequence of its side effects such as agranulocytosis, seizures and sedation. CLZ is rapidly absorbed and, prior to excretion, extensively metabolised in two major metabolites, N-desmethylclozapine (norclozapine: NCLZ) and clozapine-N-oxide (CLZNO). CLZNO is present in low amounts in the plasma of patients receiving CLZ, conversely NCLZ is present in significant amounts and usually determined along with CLZ. Most patients respond sufficiently to dosages between 300 and 500 mg/day. If improvement has not occurred, the dosage can be gradually increased to 900 mg/day. It is suggested that therapeutic response is correlated with clozapine plasma levels between 350 and 600ng/mL. Although the precisely toxic range of clozapine is not known, its side effects are considered to be dose-related. Clozapine needs to be closely monitored when its concentration is higher than 600 ng/mL in plasma. On the other hand, despite indications that NCLZ does not possess any clinical outcome, a recent review, suggests that higher NCLZ/ CLZ ratios may be associated with greater symptom improvement. These findings propose that, the complex interaction between CLZ and NCLZ at receptor sites makes it necessary for a validated method able to monitor not only CLZ but also NCLZ in clinical trials as well as in overdose and forensic cases. The aim of this study was to develop and validate a GC/MS specific method for the determination of clozapine and norclozapine in human plasma covering all therapeutic and toxic levels. A sensitive and specific GC/MS method for the determination of clozapine (CLZ) and its major metabolite norclozapine (NCLZ), in plasma has been developed, optimized and validated. Specimen preparation includes solid–phase extraction of both analytes using Bond-Elut Certify cartridge and further derivatization with TFAA. Clozapine-d8 was used as internal standard for the determination of CLZ and NCLZ. Limits of detection were 0.45ng/mL for CLZ and 1.59ng/mL for NCLZ, while limits of quantification were 1.37ng/mL for CLZ and 4.8ng/mL for NCLZ, as calculated by the calibration curves. The calibration curves were linear up to 600ng/mL for CLZ and NCLZ. Absolute recovery ranged from 82.22% to 95.35% for both analytes. Intra- and interday accuracy was less than 7.13% and −12.52%, respectively, while intra- and interday precision was between 9.5% and 12.07%, respectively, for CLZ and NCLZ. The method covers all therapeutic range and proved suitable for the determination of CLZ and NCLZ not only in psychiatric patients but also in forensic cases with clozapine implication.

Η κλοζαπίνη (CLZ) κατατάσσεται στα άτυπα αντιψυχωσικά φάρμακα λόγω των πολύπλοκων φαρμακολογικών ιδιοτήτων της και των διαφορετικών αποτελεσμάτων που παρουσιάζει σε σχέση με τα τυπικά αντιψυχωσικά. Η κλοζαπίνη είναι αποτελεσματική στη θεραπεία σχιζοφρενικών ασθενών, οι οποίοι δεν ανταποκρίνονται στα κλασικά αντιψυχωσικά φάρμακα. Ωστόσο, παρόλο που πρόκειται για ένα ευρέως χορηγούμενο φάρμακο η χρήση της κλοζαπίνης έχει περιοριστεί ως συνέπεια των παρενεργειών που προκαλεί όπως ακοκκιοκυτταραιμία, σπασμοί και καταστολή. Η κλοζαπίνη απορροφάται αμέσως να βιομετατρέπεται σε Ν-απομεθυλιωμένη κλοζαπίνη (NCLZ) και Ν-οξειδωμένη κλοζαπίνη (CLZNO). Η συγκέντρωση της CLZNO στο πλάσμα ασθενών είναι ελάχιστη, ενώ η συγκέντρωση της NCLZ φτάνει σε υψηλά επίπεδα. Για το λόγω αυτό απαιτείται ο προσδιορισμός μόνο της NCLZ στο πλάσμα ασθενών που βρίσκονται σε θεραπεία με κλοζαπίνη. Οι περισσότεροι ασθενείς ανταποκρίνονται επαρκώς σε δόσεις κλοζαπίνης μεταξύ 300 και 500 mg ανά ημέρα. Σε ασθενείς οι οποίοι δεν παρουσιάζουν βελτίωση της κλινικής τους εικόνας, σε συνήθεις θεραπευτικές δόσεις, η δόση του φαρμάκου μπορεί να αυξηθεί σταδιακά έως τα 900 mg ανά ημέρα. Οι ασθενείς ανταποκρίνονται στη θεραπεία με κλοζαπίνη όταν η συγκέντρωση της στο πλάσμα φτάσει σε επίπεδα μεταξύ 350 και 600 ng/mL. Παρόλο που τα ακριβή τοξικά επίπεδα της κλοζαπίνης δεν έχουν προσδιοριστεί, οι παρενέργειες του φαρμάκου θεωρούνται δοσοεξαρτώμενες. Όταν η συγκέντρωση της κλοζαπίνης στο πλάσμα ξεπεράσει τα 600 ng/mL, η παρακολούθηση των επιπέδων του φαρμάκου στο πλάσμα είναι αναγκαία. Έχει παρατηρηθεί ότι η αύξηση του λόγου των συγκεντρώσεων των ουσιών CNCLZ/ CCLZ μπορεί να οδηγήσει σε επιπλέον βελτίωση των κλινικών αποτελεσμάτων. Η παρατήρηση αυτή σε συνδυασμό με την πολυπλοκότητα των αλληλεπιδράσεων των ουσιών στους υποδοχείς, καθιστά τον ταυτόχρονο προσδιορισμό και των δύο ουσιών απαραίτητο, τόσο σε περιπτώσεις ασθενών όσο και σε δικαστικές υποθέσεις. Σκοπός αυτής της διατριβής ήταν η ανάπτυξη, βελτιστοποίηση και επικύρωση μεθόδου προσδιορισμού της CLZ και του κύριου δραστικού μεταβολίτη αυτής, NCLZ, σε πλάσμα, με τη σύγχρονη αναλυτική τεχνική της αεριοχρωματογραφίας σε συνδυασμό με φασματομετρία μαζών. Επιτεύχθηκε η ανάπτυξη μίας ευαίσθητης και ακριβούς μεθόδου προσδιορισμού της κλοζαπίνης και του μεταβολίτη της. Η προκατεργασία των δειγμάτων περιλαμβάνει εκχύλιση στερεής φάσης χρησιμοποιώντας στήλες εκχύλισης στερεής φάσης Bond-Elut Certify και παραγωγοποίηση των ουσιών με το αντιδραστήριο παραγωγοποίησης TFAA. Ως εσωτερικό πρότυπο και για τις δύο προσδιοριζόμενες ουσίες χρησιμοποιήθηκε η δευτεριωμένη κλοζαπίνη (Clozapine-d8). Τα κατώτατα όρια ανίχνευσης για την κλοζαπίνη και τη νορκλοζαπίνη είναι 0,45 και 1,59 ng/mL αντίστοιχα, ενώ τα κατώτατα όρια ποσοτικοποίησης για την κλοζαπίνη και τη νορκλοζαπίνη 1,37 και 4,8 ng/mL αντίστοιχα. Η προτεινόμενη μέθοδος χαρακτηρίζεται από γραμμικότητα σε εύρος συγκεντρώσεων έως 600 ng/mL. Οι τιμές επαναληψιμότητας και σχετικού σφάλματος είναι μικρότερες από 9,5% και 3,8% για την κλοζαπίνη, 7,8% και 7,1% για την νορκλοζαπίνη. Οι τιμές ενδοεργαστηριακής αναπαραγωγιμότητας και σχετικού σφάλματος είναι μικρότερες από 5,3% και -4,2% για την κλοζαπίνη, 12,07% και -12,52% για την νορκλοζαπίνη. Οι τιμές απόλυτης ανάκτησης κυμαίνονται μεταξύ των τιμών 82,22% και 95,35% και για τις δύο προσδιοριζόμενες ουσίες. Η μέθοδος παρουσιάζει ανθεκτικότητα σε παραμέτρους που αφορούν στις χρωματογραφικές συνθήκες και την προκατεργασία του βιολογικού δείγματος. Η αναπτυχθείσα μέθοδος μπορεί να εφαρμοστεί στην παρακολούθηση των επιπέδων της κλοζαπίνης και του μεταβολίτη της σε ψυχωσικούς ασθενείς, και επιπλέον σε τοξικολογικές διερευνήσεις δικαστικών υποθέσεων και περιστατικών οξειών δηλητηριάσεων από νοσοκομεία.