Η επίδραση των β₂-αδρενεργικών αγωνιστών και των κορτικοστεροειδών στα επίπεδα γλυκοζαμινογλυκανών, πρωτεογλυκανών και μεταλλοπρωτεασών του συνδετικού ιστού, σε πρωτογενείς καλλιέργειες κυττάρων από πνεύμονες ανθρώπου

Abstract

Primary cell cultures of ASMC were established from control objects, asthma and COPD patients. The cell cultures were developed with 5% FCS in the absence and presence of 10⁻⁸ M formoterol and 10⁻⁸ Μ of their combination for 0, 12 and 24 hours cell culture media were collected separately. From the cell layers GAG’s were isolated and purified by lipid extraction, digestion with pronase enzyme, DNA digestion and precipitation by the addition of ethanol quantitation. Fractionation was achieved by electrophoresis on cellulose acetate membranes. Enzymatic treatment with specific GAG degrading enzymes confirmed each GAG quantitation of HA was performed by ELISA, determination of HA molecular mass, RNA isolation, RT-PCR and western blot analysis. Asthma and COPD patients secreted lower amounts of HA, due to decreased gene and protein expression of HAS-1 and HAS-2, increased expression of HYAL1, decreased expression of CD44 and lack of the HA receptor RHAMM. The effect of corticosteroids and long-acting β₂-agonists reverse all the above results.

Αναπτύχθηκαν πρωτογενείς καλλιέργειες λείων μυϊκών κυττάρων από αεραγωγούς φυσιολογικών πνευμόνων, ασθενών με άσθμα και ΧΑΠ. Οι καλλιέργειες αναπτύχθηκαν σε 5% FCS απουσία και παρουσία 10⁻⁸ Μ του συνδυασμού τους για 0, 12 και 24 ώρες. Ακολούθησε διαχωρισμός του υπερκείμενου θρεπτικού υλικού από το κυτταρικό στρώμα. Σε κάθε δείγμα πραγματοποιήθηκε απομόνωση των GAG’s με απολιπίδωση, εξαντλητική πέψη με προνάση, πέψη με DNose, και εν τέλει οι ολικές GAG’s συλλέχθηκαν με καταβύθιση με αιθανόλη. Πραγματοποιήθηκε ποσοτικός προσδιορισμός των GAG’s, ανάλυση με ηλεκτροφορική σε οξικές κυτταρίνες, ταυτοποίηση με ειδικά ένζυμα, μέτρηση HA με ELISA, προσδιορισμός μοριακής μάζας ΗΑ, απομόνωση RNA και RT-PCR καθώς και ανοσοαποτύπωση κατά western. Διαπιστώθηκε μείωση του ΗΑ στους ασθενείς με άσθμα και ΧΑΠ. Η μείωση οφείλεται σε μειωμένη έκφραση της HAS-1 και HAS-2 και σε αυξημένη έκφραση της HYAL-1 η έκφραση του υποδοχέα CD44 μειώνεται και ο υποδοχέας RHAMM εκφράζεται μόνο στου υγιείς. Η επίδραση των κορτικοστεροειδών και των β₂-αδρενεργικών αγωνιστών αναστρέφει όλο τα παραπάνω.