Η επίδραση μεσολαβητών της νεφρικής βλάβης στο σύστημα νιτρικού οξειδίου σε ανθρώπινα σωληναριακά και μεσεγχυματικά νεφρικά κύτταρα

Abstract

The progression of renal fibrosis is characterized by loss of kidney function and deposition of extracellular matrix components. The mechanism implicated in the development of renal fibrosis involves cytokines and growth factors originating from endothelial, tubular epithelial and interstitial cells. Activated myofibloblasts derive from differentiated tubular epithelial cells trough a process called epithelial to mesenchymal transition. Various kidney injury mediators like cyclosporine‐A (CsA) are entering the luminal space of the tubules causing activation of profibrotic factors such as nitric oxide (NO) and endothelin‐1 (ET‐1). A cross talk exists between endothelin and NO systems in the regulation of vascular tone and inflammatory process. Aim of this study was to investigate the effect of cyclosporine‐A on the expression of Nitric Oxide and endothelin‐1 on cultured renal tubular cells. Human tubular epithelial cells (HK‐2) were cultured in the presence of CsA at various concentrations (0‐1,000 ng/ml). RT‐PCR was used to determine NO synthases (eNOS, iNOS) and endothelin receptors (ETR‐A, ETR‐B) and Western Blot analysis for the subsequent proteins. Similar experiments were also carried out using specific NO (L‐NAME) and endothelin receptor (BQ123, BQ 788) inhibitors. At therapeutic concentrations, CsA exerts a significant cytotoxic effect on tubular epithelial cells. A dose dependent activation of NO synthases eNOS and iNOS and endothelin receptors ET‐A and ETR‐B was observed, even at therapeutic concentrations of CsA. An interaction between NO and ET‐1 systems under the influence of CsA was also observed, since blockage of NO production was followed by down‐regulation of ET‐B while blocking of endothelin pathway with ET receptor antagonists, was followed by down‐regulation of eNOS expression.

Η εξέλιξη της χρόνιας νεφρικής νόσου χαρακτηρίζεται από προοδευτική απώλεια της νεφρικής λειτουργίας και εναπόθεση εξωκυττάριας ύλης που οδηγεί σε γενικευμένη ίνωση του νεφρικού ιστού. Στους μηχανισμούς που ενοχοποιούνται για την εξέλιξη της βλάβης αυτής προς ίνωση συμμετέχουν κυτταροκίνες και αυξητικοί παράγοντες που προέρχονται από ενδοθηλιακά, επιθηλιακά σωληναριακά κύτταρα και κύτταρα του διάμεσου νεφρικού ιστού, ενώ συνυπάρχει και de novo ενεργοποίηση μυοϊνοβλαστών με τελικό αποτέλεσμα την αυξημένη εναπόθεση εξωκυττάριας ύλης. Τα επιθηλιακά σωληναριακά κύτταρα είναι πηγή προέλευσης των ενεργοποιημένων μυοϊνοβλαστών μέσω μιας διαδικασίας που ονομάζεται επιθηλιακή προς μεσεγχυματική μετάπτωση. Διάφοροι μεσολαβητές της νεφρικής βλάβης όπως είναι και η κυκλοσπορίνη ερχόμενοι σε επαφή με κύτταρα του εγγύς εσπειραμένου σωληναρίου οδηγούν σε ενεργοποίηση προϊνωτικών παραγόντων εκκρίνοντας εξωκυττάρια ύλη. Μεταξύ αυτών των μεσολαβητών της νεφρικής βλάβης, ιδιαίτερο ρόλο φαίνεται ότι διαδραματίζουν το νιτρικό οξείδιο και η ενδοθηλίνη, δύο παράγοντες που μετέχουν σε φυσιολογικές, αλλά και παθοφυσιολογικές κυτταρικές διαδικασίες. Τα συστήματα νιτρικού οξειδίου και ενδοθηλίνης αλληλεπιδρούν μεταξύ τους σε επίπεδο υποδοχέων στο κυτταρικό επίπεδο προκαλώντας αλλαγές του αγγειακού τόνου και ενεργοποίηση ή αναστολή προϊνωτικών σημάτων. Ο σκοπός της εργασίας ήταν η μελέτη της έκφρασης των συστημάτων νιτρικού οξειδίου και ενδοθηλίνης σε σωληναριακά νεφρικά κύτταρα κάτω από την επίδραση της κυκλοσπορίνης. Χρησιμοποιήθηκαν ανθρώπινες κυτταροκαλλιέργειες νεφρικών επιθηλιακών κυττάρων του εγγύς εσπειραμένου σωληναρίου (ΗΚ‐2) τα οποία επωάσθηκαν σε θεραπευτικές και τοξικές συγκεντρώσεις κυκλοσπορίνης (CsA) και ακολούθησε η ανίχνευση του νιτρικού οξειδίου (NO), της ενδοθηλιακής και επαγώγιμης συνθετάσης του ΝΟ (e‐NOS, i‐NOS) και της ενδοθηλίνης‐1 (ET‐1) με τους Α και Β υποδοχείς της (ΕΤ‐Α, ΕΤ‐Β). Το ΝΟ μετρήθηκε σύμφωνα με τη μέθοδο Griess, ενώ η συσσώρευση της ενδοθηλίνης και των Α και Β υποδοχέων της καθώς και οι συνθετάσες του ΝΟ ανιχνεύθηκαν τόσο σε επίπεδο μεταγράφου (m‐RNA) χρησιμοποιώντας RT‐PCR, όσο και σε επίπεδο πρωτεΐνης με Western Blot ανάλυση. Πειράματα πραγματοποιήθηκαν επίσης χρησιμοποιώντας ταυτόχρονα στο επωαστικό μέσο εκτός από κυκλοσπορίνη και ειδικούς αναστολείς του ΝΟ (L‐NAME) και των υποδοχέων της ενδοθηλίνης (BQ123, BQ 788), ενώ ακολούθησε η ανίχνευση των συνθετασών του ΝΟ και των υποδοχέων της ενδοθηλίνης αντίστοιχα. Από τα πειράματα που πραγματοποιήθηκαν προκύπτει ότι η κυκλοσπορίνη ασκεί τοξική δράση σε νεφρικά σωληναριακά κύτταρα και επάγει τη συσσώρευση της ΕΤ‐1, του ΝΟ, των συνθετασών του ΝΟ και των ΕΤ‐Α και ΕΤ‐Β υποδοχέων της ΕΤ‐1. Η επαγωγή του ΕΤ‐Α υποδοχέα είναι ανεξάρτητη από την παρουσία ή μη ΝΟ, σε αντίθεση με τον ΕΤ‐Β η επαγωγή του οποίου καταστέλλεται πλήρως όταν αναστέλλεται το σύστημα του νιτρικού οξειδίου (L‐NAME). Η επαγωγή της e‐NOS από την κυκλοσπορίνη είναι απόλυτα εξαρτώμενη από το σύστημα της ΕΤ‐1, σε αντίθεση με την i‐NOS η οποία επάγεται σε σημαντικό βαθμό ακόμη και όταν το σύστημα ενδοθηλίνης αδρανοποιείται πλήρως με ειδικούς αναστολείς (BQ123 και BQ788).