Διερεύνηση του ρόλου της έκφρασης των μορίων FAS/FASL και CD40/CD40L στις μυελικές κοκκιοκυτταρικές προβαθμίδες και μελέτη των μηχανισμών ομοιόστασης της κοκκιοποίησης

Abstract

Background: CD40 is a member of tumor necrosis factor (TNF) receptor family and upon interaction with its cognate ligand (CD40L) it induces diverse biologic responses related to cell survival/growth. Because altered CD40/CD40L interactions have been associated with neutropenia, we investigated the role of CD40/CD40L on human granulopoiesis. Design-Methods: CD40 expression was assessed on immunomagnetically sorted CD34⁺, CD34⁻/CD33⁺ and CD34⁻/CD33⁻/CD15⁺ normal bone marrow (BM) cells, whch represent sequential stages of the granulocytic development. We evaluated the proportion of apoptotic cells in the above cell populations following CD40 activation. We also investigated the effect of CD40L on the production of granulopoiesis-promoting cytokines by stromal layers of long-term BM cultures that mimic the BM microenvironment. Results: CD40 and CD40L were minimally expressed on CD34⁺, CD34⁻/CD33⁺, CD34⁻/CD33⁻/CD15⁺ cells but CD40 was substantially induced in the presence of TNFα. Cross-linking of CD40 in the above cell populations resulted in induction of apoptosis that was further enhanced in the presence of FasL. CD40 activation in primary cells resulted in Fas up-regulation, providing a possible mechanism for the CD40-mediated apoptotic effect. Addition of CD40L in clonogenic assays resulted in significant decrease in the colony-forming capacity of BM mononuclear cells from patients with chronic neutropenia, presumably expressing high levels of CD40 in the progenitor cells, and this effect was reversed upon CD40 blockade. CD40 was constitutively expressed on long-term BM culture stromal cells and upon activation resulted in an increase in granulocyte-colony stimulating factor and granulocyte/macrophage-colony stimulating factor production. Conclusions: These data show that CD40/CD40L interactions may promote granulopoiesis under steady state conditions by inducing the stromal release of granulopoiesis-supporting cytokines whereas under inflammatory conditions they may affect the granulocytic progenitor/precursor cell survival by accelerating the Fas-mediated apoptosis.

Θεωρητικό Υπόβαθρο: To CD40 είναι μέλος της οικογένειας των υποδοχέων του παράγοντα νέκρωσης των όγκων (tumor necrosis factor receptor; TNFR) και κατόπιν ενεργοποίησης με το συνδέτη του CD40L επάγει διάφορες βιολογικές δράσεις που σχετίζονται με την επιβίωση και την ανάπτυξη των κυττάρων. Ωστόσο, οι διαφοροποιημένες αλληλεπιδράσεις μεταξύ CD40/CD40L, έχουν συσχετισθεί με ουδετεροπενία, και για αυτό το λόγο ελέγχθηκε ο ρόλος αυτού του ζεύγους μορίων στην ανθρώπινη κοκκιοποίηση. Σχεδιασμός-Μέθοδοι: Η έκφραση του CD40 ελέγχθηκε με κυτταρομετρία ροής σε ανοσομαγνητικά διαχωρισθέντα μυελικά CD34⁺, CD34⁻/CD33⁺ και CD34⁻/CD33⁻/CD15⁺ κύτταρα, τα οποία αντιπροσωπεύουν 3 διαδοχικά στάδια της διαφοροποίησης προς την κοκκιώδη σειρά. Εκτιμήθηκε το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων στους παραπάνω πληθυσμούς μετά από ενεργοποίηση του CD40. Μελετήθηκε επίσης η δράση του CD40L ως προς την παραγωγή κυτταροκινών που προωθούν την κοκκιοποίηση από τα στρωματικά κύτταρα μακρόχρονων υγρών καλλιεργειών. Αποτελέσματα: Στα CD34⁺, CD34⁻/CD33⁺ και CD34⁻/CD33⁻/CD15⁺ κύτταρα υπήρχε μια πολύ μικρή έκφραση του CD40, σε βασικές συνθήκες, η οποία αυξανόταν σημαντικά παρουσία TNFα. Η ενεργοποίηση του CD40 με το συνδέτη του στους παραπάνω κυτταρικούς πληθυσμούς, είχε ως αποτέλεσμα την επαγωγή της απόπτωσης, η οποία ενισχυόταν παρουσία FasL. Επιπλέον, η ενεργοποίηση του CD40 στις κοκκιοκυτταρικές προβαθμίδες είχε ως αποτέλεσμα την επαγωγή επιφανειακής έκφρασης του Fas, γεγονός το οποίο θα μπορούσε να σημαίνει μια συνεργασία μεταξύ αυτών των δύο μονοπατιών για επαγωγή απόπτωσης. Η παρουσία CD40L κατά την ανάπτυξη κλωνογονικών αποικιών μείωσε σημαντικά των αριθμό των αποικιών από μυελικά μονοπύρηνα κύτταρα ασθενών με χρόνια Ιδιοπαθή Ουδετεροπενία, πιθανόν λόγω της μεγαλύτερης έκφρασης του CD40 σε αυτές τις κοκκιοκυτταρικές προβαθμίδες, γεγονός που αντιστρέφονταν όταν απενεργοποιούνταν ο υποδοχέας CD40. Το CD40 εκφραζόταν ανελλιπώς στα στρώματα μυελικών μακρόχρονων καλλιεργειών και μετά από ενεργοποίησή του, είχε ως αποτέλεσμα την αύξηση των επιπέδων των αυξητικών παραγόντων που βοηθούν την κοκκιοποίηση. Συμπεράσματα: Τα παραπάνω δεδομένα δείχνουν ότι οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ CD40/CD40L μπορούν να προάγουν την κοκκιοποίηση υπό βασικές συνθήκες μέσω της επαγωγής αυξητικών παραγόντων που υποστηρίζουν την κοκκιοποίηση, ενώ υπό φλεγμονώδεις συνθήκες μπορεί να επηρεάσουν την επιβίωση των κοκκιοκυτταρικών προβαθμίδων επιταχύνοντας την μέσω Fas απόπτωση.