Μελέτη γλυκοζιτικών ενζύμων στο χόνδρο

Abstract

Glycosaminoglycans are linear heteropolysaccharides constisted of repeated disaccharide units, bonded to each other with O-glycosidic bond. The disaccharide unit contains most of the the times an hexuronic acid and a glycosamine. These sugars are often substituted with sulfate anions. Highly anionic extended structures are thus formed, which are capable of ionic interactions with a lot of other molecules being found in a connective tissue. Due to these interactions, glycosaminoglycans are indirectly involved to a lot of biological activities. The catabolic mechanism of these macromolecules is very well studied for the vertebrate organisms. This thesis is focused on the isolation and characterization of an enzyme, present in the cranial cartilage of the squid Illex Celebrosus Coidentii, which catabolizes glycosaminoglycans. The enzyme can be isolated with the following procedure: a. Two extractions of the tissue with 0.5M CH3COONa pH 5.8, which give the a and b extracts b. Isopycnic ultracentrifugation of the b extract and fractionation of the centrifuge tube to bD1, bD2 and bD3 c. Molecular sieving chromatography of the bD1 fraction and isolation of the subfractions which contain the enzymic activity. The detection of the enzymic activity in each step was succeeded with zymography. Due to this method it was easy to identify the enzymic zone. Although, only one zone of 90kDa was detected in the final enzymic sample, three enzymic zones were of 30kDa detected in each step of the isolation procedure. The enzyme exhibits the highest activity in 0.1M Tris/CH3COOH pH 7.0 buffer. Its substrates can be sulfated and the non-sulfated glycosamonoglycans, although it seems to show a preference to the sulfated ones. The presence of a small concentration of a mild detergent appeared to be necessary for the in vitro activity exhibition. The identification of the structure of the products be capillary electrophoresis showed that the enzyme must act as an endo-β-glycosaminidase. The common enzymic mechanism and the substrates may classify the squid enzyme as an hyaluronidase. On the other hand, the enzyme exhibits the highest activity in neutral pH, which means that it might be located in the extracellular matrix instead of the lysosomes, where the known hyaluronidases are found. This theory is supported by the fact that a satisfying enzymic quantity is extracted from the tissue by mild conditions. A lot of other isolation methods were performed during the project with no remarkable results, mainly due to the difficulty to break the interactions of the enzyme with the other macromolecules present in the extracts. The enzyme is propably participating in, in vitro interactions. If these interactions are also taking place in vivo, then these might be a kind of controlling the expression of the enzymic activity.

Οι γλυκοζαμινογλυκάνες είναι γραμμικοί ετεροπολυσακχαρίτες, αποτελούμενοι από επαναλαμβανόμενες δισακχαριτικές μονάδες, ενωμένες με Ο-γλυκοζιτικό δεσμό. Συνήθως η δισακχαριτική μονάδα αποτελείται από ένα ουρονικό οξύ και μία εξοζαμίνη. Τα σάκχαρα αυτά είναι υποκατεστημένα τις περισσότερες φορές με θειικές ομάδες. Χάρη σε αυτήν τη δομή, οι γλυκοζαμινογλυκάνες διαθέτουν υψηλή πυκνότητα ανιονικού φορτίου, γεγονός που τους επιτρέπει να αλληλεπιδρούν με πλήθος μορίων. Με αυτόν τον τρόπο, συμμετέχουν έμμεσα σε ποικίλες βιολογικές λειτουργίες. Ο τρόπος με τον οποίο αποικοδομούνται τα μόρια αυτά, είναι περισσότερο γνωστός για τα σπονδυλωτά. Λιγότερο γνωστός είναι στους ασπόνδυλους οργανισμούς. Η παρούσα διατριβή εστιάζεται στην απομόνωση ενός ενζύμου που αποικοδομεί γλυκοζαμινογλυκάνες από τον κρανιακό χόνδρο ενός ασπόνδυλου οργανισμού, του καλαμαριού Illex Celebrosus Coidentii. H προτεινόμενη πορεία απομόνωσης του ενζύμου αυτού περιλαμβάνει τα εξής στάδια: Α. Δύο διαδοχικές εκχυλίσεις με 0,5Μ CH3COONa pH 5,8, από τις οποίες προκύπτουν τα εκχυλίσματα a και b. B. Iσοπυκνική υπερφυγοκέντρηση ισορροπίας – καθίζησης του b εκχυλίσματος και κλασμάτωσή του σε bD1, bD2 και bD3. Γ. Χρωματογραφία μοριακής διήθησης του bD1 κλάσματος και απομόνωση των κλασμάτων που περιέχουν ενζυμική δραστηριότητα. Η ανίχνευση της ενζυμικής δραστικότητας σε κάθε βήμα γινόταν μέσω ζυμογραφήματος, γεγονός που επέτρεπε και την ταυτόχρονη εντόπιση των ενζυμικών ζωνών. Παρατηρήθηκε λοιπόν ότι, ενώ στα στάδια Α και Β, εμφανίζονταν τρεις ενζυμικές ζώνες των 30kDa, στο τελικό στάδιο απομόνωσης εμφανίστηκε μόνο μία των 90kDa. Το μέγιστο της ενζυμικής δράσης εκδηλώνεται σε ρυθμιστικό διάλυμα 0,1Μ Tris/CH3COOH pH 7,0, ενώ ως υποστρώματα αναγνωρίζει και τις θειωμένες και τις αθείωτες γλυκοζαμινογλυκάνες, με κάποια προτίμηση στις θειωμένες. Το ένζυμο δρα ως ενδο-β-γλυκοζαμινιδάση, όπως προέκυψε μετά από ταυτοποίηση των προϊόντων αποικοδόμησης με τριχοειδή ηλεκτροφόρηση υψηλής επίδοσης. Η παρουσία μικρής συγκέντρωσης ήπιου απορρυπαντικού, ήταν απαραίτητη για την in vitro εκδήλωση της ενζυμικής δραστικότητας. Το ένζυμο του κρανιακού χόνδρου παρουσιάζει ομοιότητες με τις γνωστές υαλουρονιδάσες, κυρίως ως προς την ενδογλυκοζαμινογλυκολυτική δράση. Εντοπίζονται όμως και διαφορές, με κυριότερη τη βέλτιστη δράση σε pH 7,0, γεγονός που υποδηλώνει πιθανή εξωκυττάρια δράση του ενζύμου.Η τελευταία θεωρία ενισχύεται από τη δυνατότητα εκχύλισης μέρους της ενζυμικής ποσότητας με ήπια εκχυλιστικά μέσα. Οι δυσκολίες που προέκυψαν κατά την εφαρμογή διαφόρων μεθόδων απομόνωσης υποδεικνύουν επίσης και τη δυνατότητα για αλληλεπιδράσεις του ενζύμου με άλλα μεγαλομόρια του ιστού, που ίσως να λειτουργούν ως μηχανισμός ρύθμισης της ενζυμικής δράσης.