Ο καρκίνος του παχέος εντέρου: απομόνωση μεμβρανικών και κυτταροπλασματικών πρωτεϊνών, ιστών του παχέος εντέρου σε βιοχημικό επίπεδο

Abstract

In this study one hundred and seventy human tissues were collected out of eighty five patients. Eighty five were cancer tissues and the rest were mirror biopsy tissues. Ten out of the eighty five patients were diagnosed with Grade A colon adenocarcinoma according to Duke’s classification, thirty five were diagnosed with Grade B colon adenocarcinoma and the rest with Grade C colon adenocarcinoma. The tissues were fractionated in cytoplasmic and membrane fractions and were analysed with 2D- Electrophresis. Furthermore, twelve tissues were collected out of six patients. Six of these tissues were cancer tissues and six mirror biopsy tissues. Two out of the six patients were diagnosed with Grade A colon adencarcinoma, two with Grade B colon adenocarcinoma and two with Grade C colon adenocarcinoma. These tissues were analysed with immunohistochemistry against Calreticulin expression.After comparison of the 2D-Gels of the normal and malignant states differences in the expression levels of Albumin, Hemoglobin, al-antitrypsin and Actin were noted. Nevertheless these differences were assessed as insignificant. Additionally three qualitative and eight quantitative differences in protein expression came up. Two out of three proteins that consist the qualitative differences were located in the cytosolic fractions and the remaining one in the membrane fraction.The two aforementioned proteins were not identified and were named Π3 and Π4. Π3 (pl:5.53, MW:13805) shows up in most of the cancer sample gels and is totally absent from all the mirror biopsy ones. On the contrary Π4(ρΙ:4.53, MW:39458) shows up in most of the mirror biopsy sample gels while being absent from all the cancer sample ones. The last protein that was located at the membrane fraction was not identified either and was called Π6. Π6 (pl:6.51, MW:11000) shows up in almost all the cancer sample gels and is absent from the mirror biopsy ones.All eight proteins that consist the qualitative differences were all located in the cytosolic fraction. Five out of these eight proteins were identified by gel to gel comparison with reference gels available over the internet. These proteins are the following: Calreticulin (pl:4.40, MW:58700), ERP29 (pl:5.65, MW:26362), Ubiquitin99(pl:6.84, MW:8761), FABP (pl:5.82, MW:13370) and GSTP1 (pl:5.42, MW:22880). Calreticulin’s identification was verified with Immunoblotting.Calreticulin expression levels in the cancer sample 2D gels are increased when compared with the expression levels of the protein in the mirror biopsy samples. That applies for all three stages of the disease. The functionality of calreticulin is very interesting. The protein is responsible for collecting and storing Ca+2, it controls the protein and glycoprotein folding in the cytoplasm and it participates in the control of transcription of specific proteins which participate in the cell adhesion process. This process is a very crucial for tumour spreading and métastasés. Bearing in mind that calreticulin expression levels increase while the disease progresses, plus the fact that the protein in mainly overexpressed in the low differentiation regions of the tissues (as shown in the immunohistochemistry section of this study) we can suggest that Calreticulin’s functional role is directly associated to tumour aggressiveness spreading and métastasés.The expression levels of ERP29 increase in Stage A cancer samples and decrease in Stage B and C ones, relative to the expression levels of the protein in the corresponding mirror biopsy samples. ERP29 is located in the endoplasmic reticulum and is activated in stress conditions. Its functionality is associated to protein folding and secretion, processes very important for cellular communication. ERP29 is very interesting because it is a protein very recently identified and our knowledge of its complete functionality is far from complete. Furthermore it seems to have common functionalities to Calreticulin.The expression levels of Ubiquitin clearly increase in all the cancer samples of all the stages relative to the ones in the mirror biopsy samples. Ubiquitin participates in protein degradation and intracellular transport. Fellow researchers have demonstrated that Ubiquitin also controls several transcription factors as well as several protein-protein interactions. Bearing that in mind that ubiquitin levels increase in cancer could biochemically indicate increased protein degradation, hence increased metabolic rate of the cancer cells. Furthermore changes in the expression levels of ubiquitin could cause differentiation in the transcription of several proteins.The expression levels of FABP decrease in the Stage A and C cancer samples, while they increase in the stage B one relative to the protein expression levels in the100mirror biopsy samples. FABP regulates lipid transport and metabolism and is abundant in the cytoplasm. FABP expression at the transcription level is regulated by the PPARy transcription factor. This transcription factor’s activation under specific circumstance inhibits cellular growth and promotes cellular differentiation in a broad set of cancer cell lines coming from large intestine epithelium. Furthermore PPARy controls the transcription of proteins responsible for cellular growth, 3 different genes belonging to the family carcinoembryonic antigens and the transcription of proteins participating in the mechanism of extracellular adhesion. Fellow researchers have shown that FABP’s expression colon cancer adenocarcinomas was not uniform. They found that cancer cells in the adenocarcinoma that had exactly the same morphology did not uniformly express FABP. The same observation was made for metastatic sites coming from colon cancer adenocarcinomas. This is an indication that even though cancer cells have exactly the same morphology under the microscope are actually biochemically different. FABP could provide a marker for more competent classification of cancer cell populations in an adenocarcinoma.The expression levels of GSTP1 increase in all the cancer samples in comparison to the mirror biopsy samples. GSTP1 belongs to an enzyme class that plays important role in the removal of toxic agents which act probably as carcinogenic factors. In the current study an increase in the levels of this protein is observed in the cancer samples fact that contradicts the aforementioned functionality. Nevertheless fellow researchers have demonstrated that in MCF7 cells which presented high resistance to chemotherapiutical agents, the levels of GSTP1 were 18fold increased in comparison to other cells from the same cell line that lacked this resistance.The three proteins that consist the remaining quantitative differences were not identified and were named Π1 (pi: 4.95 MW: 31514), Π2 (pi: 6.12 MW: 11569) and Π5 (pi: 5.20 MW: 23274).The expression levels of Π1 increase in the cancer samples relative to the ones in the mirror biopsy samples.The expression levels of Π2 increase in the Stage A cancer samples and decrease in the Stages B and C cancer samples in comparison to the expression levels of the mirror biopsy samples.101The expression levels of Π5 decrease in the Stages A and C cancer samples and increase in the Stage B cancer samples in comparison to mirror biopsy samples.The three proteins consisting the qualitative differences and the three ones consisting the quantitative differences which remained undefined are going to be identified with mass spectrometry. Additionally further study on the functionality of these proteins will be performed utilising molecular biology techniques, in order for colon cancer specific markers to be produced.102

Στη μελέτη αυτή συγκεντρώθηκαν από ογδόντα πέντε ασθενείς εκατόν εβδομήντα ιστοί παχέος εντέρου, από τους οποίους οι ογδόντα πέντε ήταν καρκινικοί και οι άλλοι ογδόντα πέντε ήταν ιστοί από βιοψία καθρέπτη (ιστός που λαμβάνεται από υγιές τμήμα του εντέρου μακριά από την παθολογική εστία). Από τους ογδόντα πέντε ασθενείς οι δέκα έπασχαν από αδενοκαρκίνωμα σταδίου A κατά Duke, οι τριάντα πέντε από αδενοκαρκίνωμα σταδίου Β και οι σαράντα από αδενοκαρκίνωμα σταδίου C. Οι ιστοί διαχωρίστηκαν σε μεμβρανικό και κυτταροπλασματικό κλάσμα και αναλύθηκαν με την τεχνική της δισδιάστατης ηλεκτροφόρησης. Επίσης από έξι ασθενείς συγκεντρώθηκαν δώδεκα ιστοί από τους οποίους έξι ήταν καρκινικοί και έξι ήταν ιστοί από καθρέπτη βιοψίας. Από τους έξι ασθενείς οι δύο έπασχαν από αδενοκρκίνωμα σταδίου Α, οι δύο έπασχαν από αδενοκαρκίνωμα σταδίου Β και οι δύο από αδενοκαρκίνωμα σταδίου C κατά Duke χαμηλής κυτταρικής διαφοροποίησης. Οι ιστοί αυτοί αναλύθηκαν με την μέθοδο της ανοσοϊστοχημείας για να μελετηθεί η έκφραση της Καλρετικουλίνης σε αυτούς.Με την τεχνική της δισδιάστατης ηλεκτροφόρησης παρατηρήθηκαν ποσοτικές διαφοροποιήσεις στις γνωστές οροπρωτεΐνες Αλβουμίνη, Αιμοσφαιρίνη και αΐ- αντιτρυψίνη, καθώς και στην Ακτίνη οι οποίες δεν είναι αξιολογήσιμες. Επιπλέον παρατηρήθηκαν τρεις ποιοτικές και οκτώ ποσοτικές διαφορές ανάμεσα στην πρωτεϊνική έκφραση της παθολογικής και φυσιολογικής κατάστασης, οι οποίες παρουσιάζουν ιδιαίτερο ενδιαφέρον.Από τις τρεις πρωτεΐνες που αποτελούν ποιοτικές διαφορές οι δύο παρατηρήθηκαν στο κυτταροπλασματικό κλάσμα και η μία στο μεμβρανικό κλάσμα. Οι δύο πρωτεΐνες που παρατηρήθηκαν στο κυτταρόπλασμα ονομάστηκαν Π3 και Π4. Η Π3 με ισοηλεκτρικό σημείο: 5.53 και μοριακό βάρος: 13805 εμφανίζεται στα ηλεκτροφορήματα καρκινικών δειγμάτων όλων των σταδίων και όλων των κυτταρικών διαφοροποιήσεων ενώ απουσιάζει από τα αντίστοιχα δείγματα καθρέπτη βιοψίας. Αντίθετα στα ηλεκτροφορήματα καθρέπτη βιοψίας όλων των σταδίων και όλων των κυτταρικών διαφοροποιήσεων εμφανίζεται η Π4 με ισοηλεκτρικό σημείο: 4.53 και μοριακό βάρος: 39458, η οποία απουσιάζει από όλα τα αντίστοιχα ηλεκτροφορήματα καρκινικών δειγμάτων. Η μία πρωτεΐνη που αποτελεί ποιοτική διαφορά και εντοπίστηκε94στο κυτταροπλασματικό κλάσμα των δειγμάτων ονομάστηκε Π6 με ισοηλεκτρικό σημείο 6.51 και μοριακό βάρος 11000 η οποία εμφανίζεται στην πλειοψηφία των ηλεκτροφορημάτων αδενοκαρκινώματος όλων των σταδίων και όλων των κυτταρικών διαφοροποιήσεων ενώ απουσιάζει παντελώς από όλα τα αντίστοιχα ηλεκτροφορήματα δειγμάτων καθρέπτη βιοψίας.Οι οκτώ πρωτεΐνες που αποτελούν ποσοτικές διαφορές παρατηρήθηκαν όλες στο κυτταροπλασματικό κλάσμα. Από τις οκτώ πρωτεΐνες οι πέντε αναγνωρίστηκαν μετά από σύγκριση με πρότυπα ηλεκτροφορήματα που είναι διαθέσιμα στο διαδίκτυο και είναι οι ακόλουθες: Καλρετικουλίνη με ισοηλεκτρικό σημείο:4.40 και μοριακό βάρος:58700, ERP29 με ισοηλεκτρικό σημείο:5.65 και μοριακό βάρος:26362, Ουβικιτίνη με ισοηλεκτρικό σημείο:6.84 και μοριακό βάρος:8761, FABP με ισοηλεκτρικό σημείο:5.82 και μοριακό βάρος: 13370 και GSTP1 με ισοηλεκτρικό σημείο:5.42 και μοριακό βάρος:22880. Η ταυτότητα της Καλρετικουλίνης πάνω στα ηλεκτροφορήματα επαληθεύτηκε με την τεχνική της ανοσοαποτύπωσης.Τα επίπεδα έκφρασης της Καλρετικουλίνης στα ηλεκτροφορήματα καρκινικών δειγμάτων είναι αυξημένα σε σχέση με αυτά που παρατηρούνται στα ηλεκτροφορήματα των καθρεπτών βιοψίας. Η λειτουργικότητα της Καλρετικουλίνης παρουσιάζει ιδιαίτερο ενδιαφέρον. Εκτός από την συλλογή και την αποθήκευση ασβεστίου και τον έλεγχο αναδίπλωσης πρωτεϊνών και γλυκοπρωτεϊνών στο κύτταροπλασμα, η Καλρετικουλίνη συμμετέχει στον έλεγχο της γονιδιακής μεταγραφής πρωτεϊνών οι οποίες συμμετέχουν στην κυτταρική πρόσφυση η οποία είναι μια διαδικασία ιδιαίτερα σημαντική για την εξάπλωση και μετάσταση του καρκίνου. Συγκεκριμένα ερευνητές έδειξαν ότι κύτταρα που υπερεξέφραζαν την Καλρετικουλίνη παρουσίαζαν αυξημένη κυτταρική πρόσφυση σε εξωκυτταρικές πρωτεΐνες. Σε συνδυασμό με όλα τα παραπάνω και λαμβάνοντας υπ’ όψη ότι: α)η Καλρετικουλίνη παρουσιάζει σταθερή ποσοτική αύξηση καθώς η νόσος προοδεύει από το στάδιο A στο C , β)ότι η Καλρετικουλίνη, όπως φαίνεται από τα δεδομένα αυτής της μελέτης, υπερεκφράζεται σε περιοχές χαμηλής κυτταρικής διαφοροποίησης του ιστού και γ)ότι οι όγκοι που παρουσιάζουν χαμηλή κυτταρική διαφοροποίηση είναι πιο επιθετικοί, συμπεραίνουμε ότι η Καλρετικουλίνη συνδέεται με την επιθετικότητα του όγκου και ότι ο λειτουργικός της ρόλος είναι άμεσα συνδεδεμένος με την καρκινική εξάπλωση και μετάσταση.95Τα επίπεδα έκφρασης της ERP29 αυξάνονται στα καρκινικά δείγματα του σταδίου A σε σχέση με τα αντίστοιχα δείγματα καθρέπτη βιοψίας και μειώνονται στα καρκινικά δείγματα των σταδίων Β και C σε σχέση με τα αντίστοιχα δείγματα καθρέπτη βιοψίας. Η ERP29 είναι μια πρωτεΐνη που βρίσκεται στο ενδοπλασματικό δίκτυο και ενεργοποιείται κάτω από αντίξοες συνθήκες για το κύτταρο. Η λειτουργικότητά της σχετίζεται με την αναδίπλωση, ωρίμανση και έκκριση πρωτεϊνών, άρα με την κυτταρική επικοινωνία, λειτουργία πολύ σπουδαία για την εξάπλωση του καρκίνου. Παρουσιάζει επίσης ιδιαίτερο ενδιαφέρον γιατί είναι μια πρωτεΐνη η οποία πρόσφατα ανιχνεύθηκε, γεγονός που σημαίνει ότι ο πλήρης λειτουργικός της ρόλος είναι ακόμα άγνωστος. Επιπλέον η λειτουργικότητά της είναι σχεδόν ταυτόσημη με μια από τις λειτουργικότητες της Καλρετικουλίνης.Τα επίπεδα έκφρασης της Ουβικιτίνης αυξάνονται σε όλα τα καρκινικά δείγματα της μελέτης αυτής σε σχέση με τα δείγματα καθρέπτη βιοψίας. Η Ουβικιτίνη συμμετέχει στις διαδικασίες της πρωτεϊνικής αποικοδόμησης και της ενδοκυτταρικής μεταφοράς. Περαιτέρω, άλλοι ερευνητές έχουν δείξει ότι η Ουβικιτίνη ελέγχει ορισμένους παράγοντες μεταγραφής καθώς και αλληλεπιδράσεις ανάμεσα σε πρωτεΐνες. Το γεγονός ότι στα καρκινικά δείγματα παρατηρείται σημαντική αύξηση των επιπέδων της Ουβικιτίνης αποτελεί, πιθανώς, ένδειξη υψηλότερης ενδοκυτωτικής δραστηριότητας και υψηλότερου ρυθμού πρωτεϊνικής αποικοδόμησης των καρκινικών κυττάρων. Αυτό το στοιχείο συμβαδίζει με την εικόνα του εντονότερου μεταβολισμού που παρουσιάζουν τα καρκινικά κύτταρα και δικαιολογεί την γρήγορη ανάπτυξη τους.Τα επίπεδα έκφρασης της FABP μειώνονται στα καρκινικά δείγματα των σταδίων A και C, ενώ αυξάνονται στα καρκινικά δείγματα του σταδίου Β σε σχέση με τα αντίστοιχα δείγματα καθρέπτη βιοψίας. Η FABP ρυθμίζει τη μεταφορά και μεταβολισμό των λιπιδίων και βρίσκεται σε αφθονία στο κυτταρόπλασμα. Η έκφραση της FABP σε μεταγραφικό επίπεδο ελέγχεται από το μεταγραφικό παράγοντα ΡΡΑΚγ, ο οποίος μαζί με τα υπόλοιπα μέλη της οικογένειας PPARa και PPARô ελέγχουν την έκφραση πρωτεϊνών που είναι υπεύθυνες για την μεταφορά και αποθήκευση λιπιδίων. Η ενεργοποίηση του ΡΡΑΒγ κάτω από συγκεκριμένες συνθήκες προκαλεί αναστολή στην κυτταρική ανάπτυξη και προάγει την διαφοροποίηση σε ένα ευρές φάσμα καρκινικών κυτταρικών σειρών προερχόμενων από επιθηλιακό ιστό του παχέος εντέρου. Επιπλέον ο ΡΡΑΕγ ελέγχει την έκφραση πρωτεϊνών που σχετίζονται με την κυτταρική ανάπτυξη, τρία96διαφορετικά γονίδια από την οικογένεια των καρκινοεμβρυακών αντιγόνων καθώς και πρωτεΐνες που παίζουν ρόλο στον μηχανισμό της εξωκυτταρικής προσκόλλησης. Ερευνητές έδειξαν ότι σε αδενοκαρκινώματα του παχεός εντέρου η έκφραση της FABP δεν ήταν ομοιόμορφη. Παρατήρησαν δηλαδή, ότι ανάμεσα σε μορφολογικά όμοια καρκινικά κύτταρα που αποτελούσαν τμήματα του αδενοκαρκινώματος, μερικά εξέφραζαν την πρωτεΐνη και άλλα όχι. Η ίδια παρατήρηση έγινε και σε μεταστάσεις προερχόμενες από αδενοκαρκινώματα του παχεός εντέρου, τα οποία φυσικά εξέφραζαν την FABP. Αυτές οι παρατηρήσεις δείχνουν ότι ανάμεσα σε φαινομενικά ίδιους πληθυσμούς καρκινικών επιθηλιακών κύτταρων υπάρχουν υποπληθυσμοί με διαφορετική βιοχημική κατάσταση και η FABP μπορεί να αποτελέσει έναν δείκτη για τον εντοπισμό αυτών των διαφορετικών υποπληθυσμών. Το παραπάνω θα έχει σαν αποτέλεσμα την καλύτερη κατηγοριοποίηση των αδενοκαρκινωμάτων του παχεός εντέρου.Τα επίπεδα έκφρασης της GSTP1 αυξάνονται σε όλα τα καρκινικά δείγματα σε σχέση με τα αντίστοιχα δείγματα καθρέπτη βιοψίας. Η GSTP1 ανήκει σε μια κατηγορία ενζύμων τα οποία παίζουν σημαντικό ρόλο στην απομάκρυνση τοξικών για το κύτταρο παραγόντων με πιθανή καρκινική δράση. Στην παρούσα μελέτη παρατηρείται ότι η ποσότητα της εν λόγω πρωτεΐνης αυξάνεται στον καρκίνο, γεγονός που έρχεται σε αντίθεση με την προαναφερθείσα λειτουργικότητα. Παρ’ όλα αυτά ερευνητές έδειξαν ότι σε κύτταρα προερχόμενα από την κυτταρική σειρά MCF7 (η οποία προέρχεται από κύτταρα του καρκίνου του μαστού) τα οποία παρουσίαζαν υψηλή αντοχή σε αντικαρκινικούς παράγοντες, η έκφραση του συγκεκριμένου ενζύμου βρέθηκε 18 φορές μεγαλύτερη σε σύγκριση με αντίστοιχα κύτταρα τα οποία δεν παρουσίαζαν αυτή την ανθεκτικότητα, στοιχείο το οποίο τονίζει την συμμετοχή του GSTP1 στον φαινότυπο αυτής της ανθεκτικότητας.Οι τρεις πρωτεΐνες που αποτελούν ποσοτικές διαφορές και δεν αναγνωρίστηκαν ονομάστηκαν Π1 με ισοηλεκτρικό σημείο:4.95 και μοριακό βάρος:31514, Π2 με ισοηλεκτρικό σημείο:6.12 και μοριακό βάρος: 1 1569 και Π5 με ισοηλεκτρικό σημείο:5.20 και μοριακό βάρος:23274.Τα επίπεδα έκφρασης της Π1 αυξάνονται στα καρκινικά δείγματα σε σχέση με τα δείγματα καθρέπτη βιοψίας.