Μελέτη μοριακών παραμέτρων στον καρκίνο του θυρεοειδούς για την αναγνώριση δεικτών πρόβλεψης ευαισθησίας σε στοχευμένη θεραπεία

Abstract

The aim of the present study was to investigate the molecular pathways and individual molecules involved in thyroid carcinogenesis in order to identify potential diagnostic markers, as well as markers predictive of sensitivity to specific therapeutic inhibitors (small molecule tyrosine kinase inhibitors, TKIs). The selected molecules are involved in molecular pathways that have been reported to exhibit genetic/functional changes in thyroid cancer and represent pharmaceutical targets. Materials and methods: Twenty cell lines and 220 patient samples were studied, out of which 139 had been classified as papillary carcinomas (PTC), 16 as follicular (FTC), 34 as myeloid (MTC), 14 were anaplastic (ATC), 11 poorly differentiated (PDTC) and 5 were non-cancerous thyroid tissue (NCTT). Genotypic analysis was carried out utilising both Real Time PCR and direct sequencing. Furthermore, the relative mRNA expression of EGFR and HER2 and their alternatively spliced isoforms, as well as the relative expression of HSP90 and the mRNAs of genes related to it, and genes encoding proteins associated with angiogenesis, was evaluated. Also, the expression of three miRNAs (MIRN146b, MIRN221, MIRN222), which seem to be associated with thyroid cancer, was studied, using in situ hybridisation and Real Time PCR. In addition, the effect of two of tyrosine kinase inhibitors [Vandetanib (ZD6474, Zactima™, AstraZeneca, Wilmington, DE) and Sunitinib (SUI 1248, Sutent®, Pfizer, New York, NY)] in thyroid cancer cell lines was studied. Results: BRAF V600E mutation was present in 38% of thyroid cancer samples (50.8% of papillary thyroid carcinomas), while RET/PTC rearrangements, were detected in only 8.33% of samples. Differences in the relative expression of EGFR were observed when using probes targeting different regions of the EGFR mRNA (amplicons for exons 10-11 and 15-17). Anaplastic carcinomas appear to have significantly different expression profiles of HER2 and var3 of EGFR compared to non-cancerous tissue (p = 0.006 and p = 0.00105, respectively), with HER2 exhibiting an increase in relative expression, whereas EGFR var3 expression appeared downregulated. RET kinase does not appear to be expressed in most tissue types studied, with the exception of medullary carcinomas. Significant differences were observed in expression profiles between tissue samples and cell lines, for almost all the molecules studied. Only thyroid carcinomas were positive for all 3 miRs studied (p < 0.00001 compared with tumours of different histological origin). Moreover, among thyroid carcinomas, overexpression of all 3 miR was significantly more frequent in PTCs compared with MTCs (p = 0.007) and ATCs (p = 0.0001). The two tyrosine kinase inhibitors investigated seemed to inhibit cell proliferation but did not ultimately lead to apoptosis. A transient inhibition in the phosphorylation of MEK and MAP kinases was also observed, as well as a change in the relative expression of DUSP6 (dual specificity phosphatase 6) and THBS1 (thrombospondin 1). However, no synergy with other chemotherapeutic agents was observed. Conclusions: BRAF V600E mutation is characteristic for PTC, but its incidence does not permit its use as a diagnostic test. The observed differences in anaplastic carcinomas on expression profiles of EGFR/HER2 and their splice variants, which are known to be endogenous HER inhibitors, should perhaps be taken into account when designing studies on the use of exogenous HER inhibitors. Furthermore, ATC appear to have a characteristic angiogenic factor expression profile, which September suggest an association with their aggressive behaviour and September also constitute a target for pharmacological inhibition. PTC and MTC on the other hand, are characterized by changes in HSP90 related mRNA expression, pointing to a role of these genes in the progression of tumors with corresponding histology. From a technical point of view, the choice of probe, as well as the position of its binding site on the mRNA, appears to be determinative for the evaluation of relative gene expression. Overexpression of miRsl46b/221/222 appears to characterize PTC. The miR in situ hybridisation method applied in this study could be used for further investigation of these miRs, and could eventually be integrated as a diagnostic tool in cytologic specimens. The tyrosine kinase inhibitors vandetanib and sunitinib inhibit cell proliferation in vitro, but do not lead to apoptosis. They seem to transiently inhibit MAP and MEK kinase phosphorylation, possibly through DUSP6 phosphatase intervention. This mechanism appears to have special significance and should be further investigated.

Στην παρούσα μελέτη έγινε διερεύνηση των αυξητικών μοριακών οδών και των επιμέρους μορίων που εμπλέκονται στην καρκινογένεση του θυρεοειδούς με στόχο την αναγνώριση πιθανών διαγνωστικών δεικτών, αλλά και δεικτών πρόβλεψης ευαισθησίας σε συγκεκριμένους θεραπευτικούς αναστολείς (μικρομοριακούς αναστολείς κινασών). Επιλέχθηκαν δείκτες που αφορούν στις μοριακές οδούς που έχουν αναφερθεί ότι φέρουν γενετικές/λειτουργικές αλλαγές στον καρκίνο του θυρεοειδούς και αποτελούν φαρμακευτικούς στόχους. Υλικά και μέθοδοι: Εξετάστηκαν συνολικά 20 κυτταρικές σειρές και 220 δείγματα ασθενών, εκ των οποίων 139 είχαν χαρακτηριστεί ως θηλώδη καρκινώματα (PTC), 16 ως θυλακιώδη (FTC), 34 ως μυελοειδή (MTC), 14 ως αναπλαστικά (ATC), 11 ως χαμηλής διαφοροποίησης (PDTC) και 5 ως μη καρκινικός ιστός (NCTT). Στα δείγματα έγινε γονοτυπική ανάλυση με Real Time PCR και ταυτοποίηση αλληλουχίας (direct sequencing) καθώς και ανάλυση σχετικής mRNA έκφρασης με Real Time PCR για τα γονίδια EGFR και HER2 και τις εναλλακτικά ματισμένες ισομορφές τους, για το γονίδιο της HSP90 και τα mRNA γονιδίων που σχετίζονται με αυτήν, καθώς και σειράς γονιδίων, τα οποία κωδικοποιούν πρωτεΐνες που σχετίζονται με την αγγειογένεση. Ακόμα, ελέγχθηκε η έκφραση τριών miRNA (MIRN146b, MIRN221, MIRN222), που φαίνεται να σχετίζονται με τον καρκίνο του θυρεοειδούς, με in situ υβριδισμό και Real Time PCR. Επιπλέον, μελετήθηκε η επίδραση δύο αναστολέων κινασών της τυροσίνης [vandetanib (ZD6474, Zactima™, AstraZeneca, Wilmington, DE) και το Sunitinib (SU 11248, Sutent®, Pfizer, New York, NY σε καρκινικές κυτταρικές σειρές θυρεοειδούς. Αποτελέσματα: Η μετάλλαξη V600E του BRAF βρέθηκε στο 38% περίπου του συνόλου των δειγμάτων (50.8% των θηλωδών καρκινωμάτων), ποσοστό που συμφωνεί με προηγούμενες μελέτες, ενώ RET/PTC αναδιατάξεις, ανιχνεύθηκαν μόλις στο 8,33% των δειγμάτων. Εντοπίστηκαν διαφορές στη σχετική έκφραση του EGFR με χρήση ανιχνευτών που στοχεύουν διαφορετικές περιοχές στο EGFR mRNA (μετάγραφο για το εξόνια 10-11 και 15-17). Τα αναπλαστικά καρκινώματα φάνηκε ότι έχουν σημαντικά διαφορετικό προφίλ έκφρασης της HER2. που φαίνεται να αυξάνεται, και της var3 του EGFR, που φαίνεται να μειώνεται, συγκριτικά με τον μη καρκινικό ιστό (p=0,006 και p=0,00105 αντίστοιχα). Ο ίδιος ιστολογικός τύπος παρουσίαζε διαφορές στο αγγειογενετικό προφίλ που ελέγχθηκε σε σχέση με τους υπόλοιπους ιστολογικούς τύπους. Παρατηρήθηκε επίσης ότι η RET κινάση δεν εκφράζεται στην πλειονότητα των ιστολογικών τύπων που μελετήθηκαν, με εξαίρεση τα μυελοειδή καρκινώματα. Επιπλέον, ήταν διαφορετικό το προφίλ έκφρασης μεταξύ ιστολογικών δειγμάτων και κυτταρικών σειρών, στο σύνολο σχεδόν των μορίων που μελετήθηκαν. Θετικότητα και για τα 3 miRs που μελετήθηκαν, παρατηρήθηκε μόνο σε θυρεοειδικά καρκινώματα (p<0.00001 σε σχέση με τους όγκους διαφορετικής ιστολογικής προέλευσης). Ανάμεσα στα θυρεοειδικά καρκινώματα, το προφίλ υπερέκφρασης και των 3 miR ήταν σημαντικά συχνότερα θετικό σε PTCs σε σχέση με τα MTCs (p=0.007) και τα ATCs (p=0.0001). Οι TKIs vandetanib και sunitinib, κατέστειλαν τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, χωρίς όμως να οδηγήσουν σε απόπτωση. Παρατηρήθηκε παροδική αναστολή της φωσφορυλίωσης των MAP και ΜΕΚ κινασών, καθώς και αλλαγή στη σχετική έκφραση της DUSP6 (φωσφατάση διπλής ειδικότητας 6) και της THBS1 (θρομβοσπονδίνη 1). Δεν παρατηρήθηκε συνέργεια με άλλα χημειοθεραπευτικά. Συμπεράσματα: Η μετάλλαξη V600E του BRAF είναι χαρακτηριστική για τα PTC, αλλά όχι σε συχνότητα τέτοια που να επιτρέπει τη χρήση της ως διαγνωστικού τεστ ρουτίνας στον καρκίνο του θυρεοειδούς. Οι διαφορές που παρατηρήθηκαν στα ATC σχετικά με την έκφραση ισομορφών των EGFR/HER2, οι οποίες αποτελούν ενδογενείς FIER αναστολείς ίσως θα πρέπει να ληφθούν υπ’ όψη κατά το σχεδίασμά μελετών με εξωγενείς αναστολείς αυτών των υποδοχέων. Επιπλέον, τα ATC παρουσιάζουν χαρακτηριστικό αγγειογενετικό προφίλ έκφρασης που πιθανώς συνδέεται με την επιθετική τους συμπεριφορά και ίσως αποτελέσει στόχο για φαρμακευτική αναστολή, ενώ τα PTC και MTC χαρακτηρίζονται από σημαντικές αλλαγές έκφρασης των γονιδίων για τις HSP90 πρωτεΐνες, οι οποίες ίσως συμμετέχουν στην ανάπτυξη αυτών των όγκων. Τεχνικά, φαίνεται ότι είναι σημαντική η επιλογή της θέσης πάνω στο mRNA του στόχου ενίσχυσης με real time PCR για τον προσδιορισμό σχετικής γονιδιακής έκφρασης. Το προφίλ υπερέκφρασης και των τριών miRsl46b/221/222 φαίνεται ότι χαρακτηρίζει τα PTC και σχετίζεται πιθανόν με καλύτερη βιολογική συμπεριφορά, ενώ μπορεί να διερευνηθεί in situ με την μέθοδο που αναπτύχθηκε στην παρούσα μελέτη. Οι TKIs vandetanib και sunitinib αναστέλλουν τον πολλαπλασιασμό καρκινικών κυττάρων θυρεοειδούς in vitro χωρίς να οδηγούν σε απόπτωση, αναστέλλοντας παροδικά την φωσφορυλίωση των MAP και ΜΕΚ κινασών, πιθανόν μέσω παρέμβασης της DUSP6 φωσφατάσης. Ο μηχανισμός αυτός παρουσιάζει ενδιαφέρον και χρήζει περαιτέρω διερεύνησης.