Απομόνωση και ανασύσταση μυκητιακών διαμεμβρανικών πρωτεϊνών: το παράδειγμα του μεταφορέα ουρικού - ξανθίνης UapA του Aspergillus nidulans

Abstract

The goal of this study was to use a proteomics-level approach to open new avenues for further exploration and better understanding of structure- function relationships in the prototype purine transporter (UapA) of the filamentous fungus, Aspergillus nidulans, a paradigm of the ubiquitous Nucleobase-Ascorbate Transporter (NAT) family. To date most studies on this very important class of transmembrane proteins have been limited to physiological, molecular and genetic approaches due to the enormous difficulties involved in isolating and purifying membrane proteins for structural studies. Structure-function relationships in UapA have so far been studied by characterizing chimeric transporters and a plethora of missense mutations. To date no study has described the protein component of the uapA gene. The main aim of this study therefore, was to isolate and purify UapA in purely functional state for eventual downstream studies including biochemical characterization, biophysical, spectroscopic, immunologic and pharmacological studies as well as attempts at crystallization. Part 1: Genetic Engineering and Analysis of Functionality of Tagged UapA. The first part of this study was based on the construction and analyses of A. nidulans strains to be used for the expression and isolation of the UapA protein. Plasmids, expressing UapA either from a native promoter or from a controllable strong promoter, were first constructed using various molecular biology techniques with different epitope tags fused to the c-terminus of UapA. These plasmids were introduced by genetic transformation to an appropriate A. nidulans strain in which the endogenous uapA gene was completely deleted. These epitope tagged versions of UapA (UapA-BAD/C, UapA-His, alc-UapA- His, UapA-RFP, UapA-GFP) were designed in order to i) study the subcellular location of UapA, ii) study its regulation of expression, and thus, to assess its optimal conditions of expression for its eventual purification, iii) immunocharacterize the protein, iv) improve yield, and finally v) assist in the purification of the protein. These epitope tagged chimeras were assessed for functionality by growth tests and for their activity by radioactive uptake studies with germinating conidiospores. While the histidine (His) tag, similarly to the green fluorescent protein (GFP) tag, proved ‘silent’ and therefore, suitable for the study of this transporter, the biotin tag (BAD/c-tail) and the monomeric red fluorescent protein (RFP) epitope tags drastically impaired the kinetic parameters of UapA. The RFP tag not only affected the transport kinetics of this transporter but also impaired its trafficking and expression in the plasma membrane and therefore, was not a suitable tool for studies concerning the physiological expression of UapA. Thus, UapA-His and UapA-GFP stood out as appropriate tools for downstream studies on UapA. Part 2: Immunodetection of UapA. The immunodetection of UapA was first performed with crude membrane proteins extracted from the UapA-His strain which expresses the protein under its native promoter. After a number of unsuccessful attempts, the UapA protein was immunodetected for the very first time as a 60 kDa band on western blot using the anti.His HRP conjugate. Given that the expression of this protein from its native promoter was very low as revealed by the immunoblots, the ale-UapA-His strain was used to express UapA from the much stronger ethanol-inducible and glucose-repressible alcA promoter. A very strong expression of UapA (> 10 fold) was obtained from this alc construct as compared to the native promoter and thus served as a valuable tool for UapA purification. Though UapA was successfully overexpressed in the αlc-UapA-His construct, work would be much easier if the expression system were E.coli. A heterologous overexpression attempt in E.coli of the cloned UapA cDNA was unsuccessful, as the UapA protein appeared unstable in bacteria. This situation is similar to other attempts of heterologous overexpression of eukaryotic transmembrane proteins in bacteria. However, the sequence of the cloned UapA cDNA permitted a reevaluation of the sequence of the uapA gene and the UapA protein as well as confirmation of various artifacts that were earlier observed in the course of sequencing several uapA mutations. The new version of the uapA gene and the UapA protein were submitted to the data bases (X71807). Part 3: Regulation of Expression of UapA. Immunocharacterization attempts with the green fluorescent protein antigenic epitope tag (UapA-GFP) led to a relatively higher level of expression of UapA from the native promoter. This made possible the study of the physiological regulation of expression of this transporter in comparison with another A. nidulans major purine transporter, AzgA. By densitometric comparison of immunoblots, UapA steady state levels reflected a 4-fold induction by purines (as compared to the non-induced state) whereas AzgA was very little affected. In the same light UapA steady state was significantly repressed by ammonium, whereas AzgA was very little affected just as was the case with purines. We also showed using the ammonium non-repressible alcA promoter that the much stronger effect of ammonium ions on UapA at the protein level was not only due to more efficient transcriptional repression as previously described, but also as a result of the fact that ammonium differentially inactivates existing UapA protein by increased protein sorting and degradation in the vacuoles. This result was in total agreement with the ammonium-promoted disappearance of UapA-GFP from the plasma membrane observed recently by epifluorescence microscopy. Part 4: Purification of UapA. UapA was successfully purified from mycelial extracts obtained from the αlc-UapA-His strain grown under conditions of optimal expression of UapA. The UapA permease was purified by Ni²⁺-NTA column affinity chromatography after being optimally solubilized by the detergent dodecyl-β-D-maltoside. Silver and coomassie stained SDS-PAGE gels showed that UapA purified to almost 100 % homogeneity as a doublet comprising a sharp band underlaid by one of relatively lesser intensity. Native-PAGE and western blot gave the same pattern. The purified UapA has been shown to be functional by tryptophane spectrofluorimetry. UapA bound its natural substrate uric acid/xanthine giving characteristic intrinsic fluorescence emission which signifies functionality. To further characterize the UapA protein, preliminary attempts were made to reconstitute into proteoliposomes but mediated [³H]xanthine uptake measurements with the reconstituted vesicles were unsuccessful. This is one of the rare eukaryotic membrane proteins to be purified directly from its native organism without recour to different expression systems. Part 5: Does UapA Oligomerize? In this last part of the study we engineered and analysed tools that will subsequently be used to evaluate the oligomeric state of UapA. Higher bands were observed above the UapA band in various western blots particularly during the regulation of expression studies and this led to the suggestion of possible oligomerization of UapA. To study this further, strains coexpressing simultaneously differentially tagged UapA, AzgA and UaZ proteins were constructed for eventual coimmunoprecipitation assays and cross-linking experiments to assess the molecular mass and the oligomeric state of UapA. This will highlight whether UapA homo-oligomerizes, hetero-oligomerizes or if it interacts with enzymes of purine metabolism. It would be very interesting to know the oligomeric state of UapA on the membrane and its functional significance; whether or not the interaction of its monomers is important for its symporter activity.

Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν η χρήση μοριακών εργαλείων για την ανάπτυξη καινοτόμων προσεγγίσεων στη μελέτη και την περαιτέρω κατανόηση των σχέσεων δομής-λειτουργίας του μεταφορέα πουρινών (UapA) στο νηματοειδή μύκητα Aspergillus nìdulans. Η συγκεκριμένη πρωτεΐνη αποτελεί ένα μοντέλο μελέτης για την ευρέως διαδεδομένη οικογένεια μεταφορέων NAT (Nucleobase Ascorbate Transporters). Μέχρι σήμερα, οι περισσότερες μελέτες που αφορούν τη συγκεκριμένη κατηγορία διαμεμβρανικών πρωτεϊνών περιορίζονται στο επίπεδο των φυσιολογικών, μοριακών και γενετικών προσεγγίσεων, κυρίως λόγω των πειραματικών δυσκολιών που χαρακτηρίζουν την απομόνωση και τον καθαρισμό διαμεμβρανικών πρωτεϊνών. Οι σχέσεις δομής-λειτουργίας του UapA έχουν έως τώρα μελετηθεί μέσω του χαρακτηρισμού χιμαιρικών μορφών του μεταφορέα καθώς και πληθώρας σημειακών μεταλλαγών. Μέχρι σήμερα, δεν έχουν αναφερθεί μελέτες που να αφορούν στο πρωτεϊνικό προϊόν του γονιδίου uapA. Με βάση τα παραπάνω, ο κύριος στόχος της παρούσας διατριβής ήταν η απομόνωση και ο χαρακτηρισμός του UapA σε πλήρως λειτουργική κατάσταση για περαιτέρω βιοχημικές, βιοφυσικές, φασματοσκοπικές, ανοσολογικές και φαρμακολογικές μελέτες καθώς και για προσπάθειες κρυστάλλωσης. Μέρος 1: Ανάπτυξη γενετικών και μοριακών «εργαλείων» για τη μελέτη της έκφρασης και απομόνωσης του μεταφορέα UapA. Στο πρώτο μέρος της παρούσας διατριβής κατασκευάστηκαν και μελετήθηκαν στελέχη του A. nìdulans που θα επέτρεπαν τη μελέτη της έκφρασης και απομόνωσης της πρωτεΐνης UapA. Σε πρώτη φάση κατασκευάστηκαν, με μεθόδους μοριακής βιολογίας, πλασμιδιακοί φορείς που εκφράζουν, είτε από τον φυσικό είτε από ελεγχόμενο ισχυρό υποκινητή, την πρωτεΐνη UapA σημασμένη με διαφορετικούς πεπτιδικούς επίτοπους που θα επέτρεπαν τον ανοσοεντοπισμό, τον κυτταρικό εντοπισμό, αλλά και την απομόνωση της πρωτεΐνης. Οι φορείς αυτοί (UapA-BAD/C, UapA-His, αlc-UapA-His, UapA-RFP, UapA-GFP) εισήχθησαν με γενετικό μετασχηματισμό σε κατάλληλα στελέχη A. nidulans όπου η ενδογενής μορφή του UapA είχε απενεργοποιηθεί πλήρως (ΔuapA) και επιλεγμένα, μέσω φυσιολογικών και μοριακών αναλύσεων, στελέχη που έφεραν λειτουργική και σταθερή απλή ενσωμάτωσή τους στο γονιδίωμα χρησιμοποιήθηκαν για: α) τη μελέτη του υποκυτταρικού εντοπισμού του UapA, β) τον προσδιορισμό των άριστων συνθηκών έκφρασής του UapA, γ) τον ανοσοχαρακτηρισμό της πρωτεΐνης και τη βελτίωση της απόδοσης της διαδικασίας αυτής, και τέλος δ) τον καθαρισμό της πρωτεΐνης. Αρχικά, η λειτουργικότητα των χιμαιρικών μορίων UapA-BAD/C, UapA- His, αlc-UapA-His, UapA-RFP, UapA-GFP ελέγχθηκε μέσω δοκιμασιών ανάπτυξης παρουσία πουρινών καθώς και μέσω της μελέτης της πρόσληψης ραδιοσημασμένων υποστρωμάτων από εκβλαστάνοντα κονιδιοσπόρια. Οι επίτοποι ιστιδίνης (His) και πράσινης φθορίζουσας πρωτεΐνης (GFP) δεν επηρέασαν καθόλου τη λειτουργικότητα (κινητικά χαρακτηριστικά, εξειδίκευση, στόχευση στη πλασματική μεμβράνη) του μεταφορέα σε αντίθεση με τους επίτοπους βιοτίνης (BAD/c-tail) και μονομερούς κόκκινης φθορίζουσας πρωτεΐνης (RFP) οι οποίοι επηρέασαν σημαντικά τις κινητικές παραμέτρους του UapA. Η προσθήκη του επίτοπου RFP επηρέασε επιπλέον τη φυσιολογική τοπογένεση του UapA ως προς την κυτταρική μεμβράνη. Με βάση τα παραπάνω αποτελέσματα, για τη συνέχεια των μελετών μας επιλέχθηκαν τα σημασμένα με τους επίτοπους μόρια, UapA-His και UapA-GFP. Μέρος 2: Ανοσοανίχνευση του UapA. Αρχικά, η ανοσοανίχνευση του UapA πραγματοποιήθηκε σε μεμβρανικό πρωτεϊνικό κλάσμα στελέχους το οποίο εκφράζει την πρωτεΐνη UapA-His, υπό το φυσικό υποκινητή της. Μετά από έναν αριθμό προσπαθειών, η πρωτεΐνη UapA ανιχνεύτηκε για πρώτη φορά σε ανοσοκηλίδωμα Western στα 60 kDa χρησιμοποιώντας συνδυασμένο αντίσωμα anti-His HRP. Με δεδομένο ότι η έκφραση της πρωτεΐνης υπό το φυσικό υποκινητή ήταν πολύ χαμηλή, χρησιμοποιήσαμε το στέλεχος αlc-UapA-His στο οποίο η έκφραση του UapA ελέγχεται από τον πολύ ισχυρότερο και ελεγχόμενο (επαγόμενο από αιθανόλη-αναστελλόμενο από γλυκόζη) υποκινητή alcA. Με το συγκεκριμένο στέλεχος επιτεύχθηκαν πολύ υψηλότερα επίπεδα έκφρασης του UapA (> 10 φορές αύξηση) σε σύγκριση με το φυσικό υποκινητή, γεγονός που διευκόλυνε σημαντικά τον καθαρισμό της πρωτεΐνης (Μέρος 4). Παρόλη την επιτυχία της παραπάνω προσπάθειας, θεωρήθηκε πως η όλη πειραματική διαδικασία καθαρισμού του μεταφορέα θα διευκολυνόταν περαιτέρω εάν χρησιμοποιούσαμε το βακτήριο E. coli ως σύστημα έκφρασης. Η προσπάθεια ετερόλογης υπερ-έκφρασης του κλωνοποιημένου cDNA του UapA στο E. coli δεν ήταν επιτυχής, καθώς η πρωτεΐνη UapA αποδείχτηκε ασταθής στα βακτήρια. Το γεγονός αυτό συμπίπτει με παρόμοιες προσπάθειες άλλων εργαστηρίων να εκφράσουν ευκαρυωτικές διαμεμβρανικές πρωτεΐνες σε βακτήρια. Παρόλα αυτά, η αλληλούχιση του κλωνοποιημένου cDNA του UapA επέτρεψε την επαναξιολόγηση της αλληλουχίας του γονιδίου uapΑ και της πρωτεΐνης UapA, γεγονός που είχε ως αποτέλεσμα την επιδιόρθωση ορισμένων σφαλμάτων που είχαν παρατηρηθεί στο παρελθόν κατά την αλληλούχιση αρκετών μεταλλαγών του uapA. Οι διορθωμένες αλληλουχίες του γονιδίου uapA και της πρωτεΐνης UapA έχουν κατατεθεί σε σχετικές τράπεζες δεδομένων (Χ71807). Μέρος 3: Μελέτες ρύθμισης της έκφρασης του UapA. Πειραματικές βελτιώσεις στη διαδικασία ανοσοχαρακτηρισμού του σημασμένου με τον επίτοπο της πράσινης φθορίζουσας πρωτεΐνης UapA (UapA-GFP) είχαν ως αποτέλεσμα υψηλότερα επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης υπό τον έλεγχο του φυσικού του υποκινητή. Το γεγονός αυτό μας έδωσε τη δυνατότητα μελέτης της ρύθμισης της φυσιολογικής έκφρασης του μεταφορέα, σε σύγκριση με έναν άλλο μεταφορέα πουρινών του A. nidulans, τον AzgA. Μετρώντας την πυκνότητα των ανοσοκηλιδωμάτων, πιστοποιήθηκε μια επαγωγή των επιπέδων UapA παρουσία πουρινών (περίπου 4-φορές) σε σχέση με την μη-επαγόμενη κατάσταση. Αντίθετα τα επίπεδα του AzgA επηρεάστηκαν ελάχιστα. Με την ίδια μεθοδολογία, η έκφραση του UapA φάνηκε να καταστέλλεται σημαντικά από την παρουσία ιόντων αμμωνίου, γεγονός που και πάλι δεν παρατηρήθηκε για τον AzgA. Χρησιμοποιώντας το στέλεχος με τον υποκινητή alcA (ο οποίος δε καταστέλλεται από τα αμμωνιακά ιόντα) πιστοποιήθηκε επίσης πως η πολύ σημαντική επίδραση των ιόντων αμμωνίου πάνω στα επίπεδα της πρωτεΐνης UapA, δεν οφείλεται μόνο σε αυξημένη μεταγραφική καταστολή όπως έχει υποστηριχτεί στο παρελθόν, αλλά επίσης στην επαγωγή ενός μηχανισμού ενδοκύτωσης και απενεργοποίησης της υπάρχουσας πρωτεΐνης στα χυμοτόπια. Τα αποτελέσματα αυτά βρίσκονται σε πλήρη συμφωνία με την επαγόμενη από τα ιόντα αμμωνίου εξαφάνιση του UapA-GFP από την κυτταρική μεμβράνη η οποία παρατηρήθηκε πρόσφατα σε μελέτες μικροσκοπίας επιφθορισμού. Μέρος 4: Καθαρισμός του UapA. Ο καθαρισμός του UapA επιτεύχθηκε χρησιμοποιώντας μυκηλιακό εκχύλισμα το οποίο παράχθηκε κατά την αύξηση του μικροοργανισμού (στέλεχος αlc-UapA-His) σε συνθήκες άριστες για την έκφραση του UapA (νέο μυκήλιο υπό την απουσία ιόντων αμμωνίου). Για τον καθαρισμό χρησιμοποιήθηκε υγρή χρωματογραφία συγγένειας σε στήλη Ni²⁺-NTA αφού προηγήθηκε αριστοποίηση των συνθηκών διαλυτοποίησης της πρωτεΐνης με τη βοήθεια της τασιενεργού ένωσης dodecyl-β-D-maltoside. Η καθαρότητα της πρωτεΐνης ελέγχθηκε με ηλεκτροφόρηση SDS-PAGE και βαφή του πηκτώματος με χρωστική Coomassie και νιτρικό άργυρο. Η πρωτεΐνη UapA καθαρίστηκε σχεδόν 100%, καθώς στα πηκτώματα SDS-PAGE εμφανίστηκε μόνο μια διπλή ζώνη η οποία αποτελείτο από μια ισχυρή και μια ασθενή ζώνη με ελάχιστα χαμηλότερο μοριακό βάρος. Αντίστοιχα αποτελέσματα ελήφθησαν τόσο στα πηκτώματα ηλεκτροφόρησης Native-PAGE όσο και στα πηκτώματα ανοσοκηλίδωσης κατά Western. Η καθαρισμένη πρωτεΐνη UapA χρησιμοποιήθηκε σε πειράματα ανασύστασης σε πρωτεολιποσώματα και πραγματοποιείται η πιστοποίηση της λειτουργικότητάς της με πειράματα πρόσληψης ραδιοσημασμένων ενώσεων. Παράλληλα, η λειτουργικότητα της απομονωμένης πρωτεΐνης UapA πιστοποιήθηκε σε πειράματα φθορισμομετρίας τρυπτοφάνης. Η όλη εργασία αποτελεί μια από τις σπάνιες περιπτώσεις καθαρισμού ενός ευκαρυωτικού διαμεμβρανικού μεταφορέα απ’ ευθείας από το φυσικό στέλεχος χωρίς τη χρήση ετερόλογων συστημάτων έκφρασης. Μέρος 5: Μελέτες ολιγομερισμού του UapA. Στο τελευταίο μέρος της εργασίας αναπτύξαμε και αξιολογήσαμε μοριακά εργαλεία για να χρησιμοποιηθούν στη μελέτη πιθανού, όπως έχουν υποδείξει προηγούμενες γενετικές μελέτες, ολιγομερισμού του UapA. Σε συμφωνία με τις γενετικές μελέτες, ζώνες υψηλότερου μοριακού βάρους από αυτήν του UapA παρατηρήθηκαν στα ανοσοκηλιδώματα κατά Western κατά τη διάρκεια των μελετών ρύθμισης της έκφρασης. Για να μελετηθεί περαιτέρω η συγκεκριμένη υπόθεση, κατασκευάστηκαν στελέχη τα οποία συνέκφραζαν διαφορικώς σημασμένους μεταφορείς (UapA, AzgA) και ένζυμα του μεταβολισμού πουρινών (Uaz-οξειδάση του ουρικού οξέος), που θα χρησιμοποιηθούν σε πειράματα συν-ανοσοκατακρήμνισης και «cross-linking» με στόχο τον προσδιορισμό του μοριακού βάρους και της κατάστασης των πιθανών ολιγομερών του UapA. Οι συγκεκριμένες μελέτες θα καταδείξουν εάν ο UapA ομο- ή έτερο-ολιγομερίζεται, εάν αλληλεπιδρά με ένζυμα του μεταβολισμού των πουρινών, καθώς επίσης και την επίδραση του ενδεχόμενου ολιγομερισμού στη μεταφορική λειτουργία της πρωτεΐνης.