Διερεύνηση του μηχανισμού του κυτταρικού θανάτου που προκαλείται από τη συνδυασμένη δράση ταξανών και υπερθερμίας

Abstract

Background In vitro the cellular effect of hyperthermia depends on the duration and the level of temperature used. Apart from the temperature administered and the histological cellular characteristics of the tissue, the survival curve is influence by several factors including hypoxia, pH and blood flow. The influences of all these factors ultimately cause apoptosis or necrosis. : Taxanes are plant alkaloids commonly used in the treatment of human carcinomas. They bind with high affinity to the β-subunit of tubulin, causing decreased dynamic instability and increased microtubule rigidity, leading to mitotic blockade. The cellular effects of the drug vary, depending on dose and treatment scheme. The cells usually die due to apoptosis. Conflicting results have been reported from in vitro and in vivo studies on the combination of paclitaxel with hyperthermia. These studies varied in drug concentration, exposure time, degree and duration of hyperthermia and cell type studied. During Continuous Hyperthermic Peritoneal Perfusion Chemotherapy, (CHPPC) for primary or secondary peritoneal malignancies, tumour cells are exposed to high drug concentrations for a relatively short period of time. We investigated in vitro the effect of paclitaxel and hyperthermia on cell proliferation, cell cycle kinetics and cell death under conditions resembling those during CHPPC. Methods After the various treatments cell proliferation was determined using MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide; Thiazol blue). Cell cycle analysis : Human breast MCF-7, ovarian SK-OV-3 and cervical HeLa cells were exposed to 10 and 20 μM paclitaxel at 37, 41.5 or 43C for 2 h. 22 was done after the cells were treated in order to stain the DNA using the DNAPrep Coulter Reagent Kit (Beckman Coulter). Samples were subjected to FACS in a Coulter Epics Elite. The number of alive and dead cells was determined by incubating a fraction of total cells with Trypan Blue, placing the cell suspension in a Neubauer hemocytometer and counting the number of cells which incorporated (dead) or excluded (alive) the dye under a conventional microscope. Apoptosis was assayed by TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling (TUNEL) assay. TUNEL assays were performed using an in situ cell death detection kit obtained from Boehringer Mannheim. All samples were analyzed by flow cytometry (FACS) in a Coulter Epics Elite. Results At the first 24h hyperthermia showed an additive effect on cell necrosis at all cultures (up to 80% on HeLa cells). After 24h this effect was diminished. The MCF-7 cells were necrotic at 30% after 7 days, the SK-OV-3 at 70% after 7 days and the HeLa cells at 80% after 2 days. : Hyperthermia alone exerted a cytostatic effect to all cell lines (stable initial cell population) and at 43οC a cytotoxic effect on MCF-7 and HeLa cells (a decrease of initial cell population at 30% and 60% respectively). Hyperthermia did not alter the cytotoxic effect of paclitaxel on HeLa cells. (50% decrease of the initial population). Hyperthermia also did not influence the mild cytostatic effect of paclitaxel on SK-OV-3 cells. Paclitaxel exerted a cytostatic effect on the MCF-7 cells at 37οC, 41.5οC and a cytotoxic at 43 οC (50% decrease of the initial population) Apoptosis as a result of the treatments was minimal and did not affected by hyperthermia. HeLa cells were apoptotic at 18% after 3 days and SK-O-V3 cells at 20% after 5 days. The MCF-7 cells did not exert any apoptotic cells. 23 MCF-7, HeLa and SK-OV-3 cells treated under normothermic conditions with paclitaxel were arrested at G2/M or M phase for a minimum 60% for at least 3 days. Hyperthermia at 41.5οC altered cell cycle distribution and affected the paclitaxel-related effect on cell cycle kinetics of MCF-7 cells (43% of the cells at G2/M phase after 3 days). The subpopulation of G2/M cells consisted of mitotic and multinucleated cells. A direct (proportional) relationship between the decrease of the number of mitotic cells and the appearance of multinucleated cells was observed (except of the MCF-7 cells). When paclitaxel was combined with hyperthermia this balance between mitotic and multinucleated cells was disturbed, without stopping the formation of multinucleated cells. After 5 days the majority of the cells of the subpopulation G2/M were multinucleated at all cell lines...

Εισαγωγή: Η δράση της υπερθερμίας στα κύτταρα εξαρτάται από την κυτταρική σειρά, την ένταση και τη διάρκεια της. Σε ήπια υπερθερμία προκαλείται αναστολή της έκφρασης πολλών γονιδίων και επαγωγή της έκφρασης heat-shock πρωτεϊνών. Γενικά αυξάνεται η διαπερατότητα των κυτταρικών μεμβρανών και αναστέλλεται ο κυτταρικός κύκλος. Σε συνθήκες αυξημένης έντασης και διάρκειας της υπερθερμίας τα κύτταρα οδηγούνται σε απόπτωση ή νέκρωση. Οι ταξάνες είναι μια ομάδα χημειοθεραπευτικών με πολύ θετικά αποτελέσματα στη θεραπεία διάφορων νεοπλασιών. Η κύρια δράση των ταξανών είναι η σύνδεσή τους στην β-τουμπουλίνη η οποία είναι υπομονάδα των μικροσωληνίσκων. Ως αποτέλεσμα έχουμε αλλαγή της δυναμικής και σταθεροποίηση των μικροσωληνίσκων, η οποία οδηγεί σε ακινητοποίηση των κυττάρων στην G2/M φάση του κυτταρικού κύκλου. Τα κύτταρα τελικά πεθαίνουν μέσω διάφορων οδών. Αρκετές in vitro και in vivo μελέτες έχουν δείξει ότι ο συνδυασμός χημειοθεραπείας και υπερθερμίας είναι αποτελεσματικότερος, απ' ότι η κάθε αγωγή μόνη της, πιθανά ενεργώντας συνεργιστικά ή προσθετικά. Υπάρχουν όμως αντικρουόμενα δεδομένα όσον αφορά στη συνεργιστική δράση της υπερθερμίας στην κυτταροτοξικότητα των ταξανών. Ως εκ τούτου, μελετήσαμε in vitro το μηχανισμό δράσης της πακλιταξέλης, της υπερθερμίας και τον συνδυασμό τους σε διάφορες κυτταρικές σειρές, σε συνθήκες που ισχύουν στην διεγχειρητική υπέρθερμη ενδοπεριτοναϊκή χημειοθεραπεία. 17 Υλικά-Μέθοδοι: Για τη μέτρηση των ζωντανών και νεκρών κυττάρων χρησιμοποιήθηκε χρώση με Trypan Blue και μέτρηση με το αιματοκυτταρόμετρο Malassez. Το ποσοστό των κυττάρων στις φάσεις του κυτταρικού κύκλου μετρήθηκε με κυτταρομετρία ροής (FACS), αφού έγινε πρώτα χρώση του DNA των κυττάρων με ιωδιούχο προπίδιο (PI).Ο προγραμματισμένος κυτταρικός θάνατος (απόπτωση) εκτιμήθηκε αρχικά παρατηρώντας στο μικροσκόπιο φθορισμού το βαθμό συμπύκνωσης του DNA των κυττάρων μετά από χρώση με DAPI. Κατόπιν χρησιμοποιήσαμε τη δοκιμασία TUNEL και μέτρηση των κυττάρων με κυτταρομετρία ροής. Το δυναμικό πολλαπλασιασμού των κυτταρικών καλλιεργειών εκτιμήθηκε με το αντιδραστήριο MTT (3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]2,5-diphenyltetrazolium bromide; Thiazol blue). Η μορφολογία του πυρήνα και οι βλάβες του πυρηνικού φακέλου εκτιμήθηκαν μετά από χρώση του πυρηνικού φακέλου με ειδικά Χρησιμοποιήθηκαν οι κυτταρικές σειρές HeLa (ανθρώπινο αδενοκαρκίνωμα τράχηλου μήτρας), MCF-7 (ανθρώπινο αδενοκαρκίνωμα μαστού) και SK-OV-3 (ανθρώπινο αδενοκαρκίνωμα ωοθηκών). Το σχήμα της χημειοθεραπείας που εφαρμόσαμε, προσομοιάζει τις συνθήκες που εφαρμόζονται στη διεγχειρητική υπέρθερμη ενδοπεριτοναϊκή χημειοθεραπεία (Continuous Hyperthermic Peritoneal Perfusion Chemotherapy, CHPPC): επώαση των κυττάρων για 2 ώρες με διαφορετικές συγκεντρώσεις (5-20 μΜ) πακλιταξέλης σε θερμοκρασία 37οC, 41,5οC, ή 43οC και στη συνέχεια την καλλιέργειά τους στους 37οC σε κανονικές συνθήκες ανάπτυξης για αρκετές ημέρες. Κατά τη διάρκεια της καλλιέργειας προσδιορίστηκαν το δυναμικό πολλαπλασιασμού των κυττάρων, ο αριθμός των ζωντανών, νεκρών και αποπτωτικών κυττάρων, τα ποσοστά της κατανομής των κυττάρων στις διάφορες φάσεις του κυτταρικού κύκλου, η μορφολογία του πυρήνα και οι βλάβες του πυρηνικού φακέλου. 18 αντισώματα, ανοσοφθορισμό και παρατήρηση των δειγμάτων στο συνεστιακό μικροσκόπιο. Αποτελέσματα Η νέκρωση των κυττάρων προσδιορίστηκε αμέσως μετά το τέλος της εφαρμογής του θεραπευτικού σχήματος (άμεση νέκρωση) και ανά 24ωρο κατά την διάρκεια της καλλιέργειας η οποία διήρκεσε 7 ημέρες (απώτερη νέκρωση). Η άμεση νέκρωση διαπιστώθηκε ότι εξαρτάται αναλογικά από την συγκέντρωση της πακλιταξέλης και το ύψος της θερμοκρασίας. Η υπερθερμία έδειξε ότι έχει κυτταροτοξικές ιδιότητες και ότι δρα συνεργιστικά με την πακλιταξέλη (μέχρι 80% νέκρωση στα κύτταρα HeLa). Στη συνέχεια των πειραμάτων επιλέχθηκε σχήμα που πλησιάζει πιο πολύ στην κλινική πράξη και περιελάμβανε συγκέντρωση πακλιταξέλης 10μM και υπερθερμίας στους 41,5οC. Στη μελέτη της απώτερης νέκρωσης φάνηκε ότι η υπερθερμία δεν επηρεάζει τη δράση της πακλιταξέλης. Τα κύτταρα ΜCF-7 παρουσίασαν το μικρότερο ποσοστό νέκρωσης (30% : Επώαση των κυττάρων στους 41,5οC (ήπια υπερθερμία) προκάλεσε αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού σε όλες τις κυτταρικές σειρές, χωρίς όμως να σημειωθεί μείωση του αρχικού κυτταρικού πληθυσμού (κυτταροστατική δράση). Όταν τα κύτταρα επωάστηκαν στους 43οC παρατηρήθηκε κυτταροστατική δράση για την κυτταρική σειρά SKOV-3, ενώ μετρήθηκε μείωση του αρχικού κυτταρικού πληθυσμού (κυτταροτοξική δράση) στα HeLa και MCF-7 κατά 30% και 60% αντίστοιχα. Η υπερθερμία δεν διαφοροποίησε την κυτταροτοξική ή την ήπια κυτταροστατική δράση της πακλιταξέλης που σημειώθηκε στα κύτταρα HeLa ή SK-OV-3, αντίστοιχα. Στα κύτταρα MCF-7 η πακλιταξέλη είχε κυτταροστατική δράση στους 37οC και 41,5οC και κυτταροτοξική δράση στους 43οC (μείωση του αρχικού πληθυσμού κατά 50% στους 43οC). 19 νεκρών κυττάρων μετά 7 ημέρες), ενώ τα SK-OV-3 παρουσίασαν ποσοστά νέκρωσης 70% στις 7 ημέρες και τα HeLa τα μεγαλύτερα ποσοστά νέκρωσης (80% στις 3 ημέρες)....