Μοριακή διερεύνηση ατόμων με προβλήματα στη διαφοροποίηση του φύλου και υπογονιμότητα

Abstract

Sex determination and differentiation in humans is based on a cascade of multiple genetic events. SRY (sex-determining region of Y) gene and Androgen Receptor (AR) gene are factors of great importance in this procedure. Mutations on SRY and AR genes lead to multiple phenotypes which mainly include Pure Gonadal Dysgenesis (PGD) syndrome and complete or partial Androgen Insensitivity Syndrome (AIS), respectively. Fertility is a basic characteristic of complete male phenotype. Male infertility is correlated with several hormonal, environmental and genetic factors. The second most common cause of male infertility is the presence of deletions along the Azoospermia Factor (AZF) on Y chromosome’s long arm. The object of this survey is the molecular analysis of SRY and AR genes in individuals presenting with various defects of virilization as well as the detection of AZF microdeletions in infertile men. The study includes a total number of 198 patients categorized in: a. 51 individuals with a 46,ΧΥ karyotype and either complete sex reversal (male to female) or incomplete masculinization: 17 individuals with complete AIS, 24 with partial AIS, 7 with PGD and 3 with cryptorchidism. b. Three male individuals with female to male sex reversal and karyotypes 46, ΧΧ (2 individuals) and 45, X (1 individual). c. Four individuals with mosaic karyotypes and phenotypic features of Turner syndrome. d. 140 infertile male subjects with normal karyotypes: 16 azoospermic and 100 oligospermic patients, 14 with oligoasthenospermia, 3 with oligoasthenoteratospermia and 7 with severe oligospermia or oligoasthenoteratospermia. SRY HMG-box region (considered as the mutation “hot spot”) as well as exons 2-8 of AR gene were amplified and sequenced for the detection of either large deletions or point mutations. Three multiplex PCR reactions (allowing the study of 11 different loci) were performed for the identification of deletions along the AZF region Analysis of the AR gene of 37 non-related patients with either complete (10 patients) or partial AIS (24 patients) or cryptorchidism (3 patients) revealed six mutations: p.V886M, p.N705S, exon 2 del, p.L881P, p.Q711RfsX787 and c.2317-18 T>Α. Of those, mutations p.L881P, p.Q711RfsX787 and c.2317-18T>Α have not been previously reported. The molecular analysis of SRY gene revealed two mutations, an HMG-box deletion and a novel frameshift mutation (p.Glu89ArgFsX10), both within the PGD group. AZF microdeletion was detected in only one out of the 100 males referred with oligospermia and as defined by the absence of PCR products for both sY254 and sY255 loci,was considered an AZFc (b2/b4) deletion. Molecular analysis of SRY and AR genes is of high importance when studying individuals with sex differentiation abnormalities since it provides valuable information for the characterization of the molecular alterations leading to either sex reversal or incomplete virilization. The detection of AZF deletions, on the other hand, allows correct and reliable genetic counseling, particularly when undergoing In Vitro fertilization.

Ο στρατηγικός ρόλος του γονιδίου καθορισμού του φύλου SRY (sex-determining region of Y) στον φυλετικό καθορισμό και του γονιδίου του υποδοχέα των ανδρογόνων AR (androgen receptor) στην επακόλουθη διαφοροποίηση του άρρενος φύλου είναι αδιαμφισβήτητος. Μεταλλάξεις στα γονίδια SRY και AR οδηγούν σε ποικιλία φαινοτύπων, οι βασικότεροι εκ των οποίων περιγράφονται στα σύνδρομα της ΧΥ αμιγούς γοναδικής δυσγενεσίας (pure gonadal dysgenesis, PGD) και της αντίστασης στα ανδρογόνα (androgen insensitivity syndrome, AIS) αντίστοιχα. Ο ανδρικός φαινότυπος ολοκληρώνεται με την ανάπτυξη των δευτερευόντων χαρακτηριστικών του φύλου και την απόκτηση της ικανότητας αναπαραγωγής κατά την εφηβική περίοδο. Η ανδρική υπογονιμότητα έχει τη βάση της σε πολλούς ορμονικούς, περιβαλλοντικούς και γενετικούς παράγοντες. Η δεύτερη σε σειρά συχνότητας γενετική αιτία της ανδρικής υπογονιμότητας είναι τα ελλείμματα στην περιοχή του παράγοντα της αζωοσπερμίας AZF (azoospermic factor). Η παρούσα μελέτη ασχολείται αφενός με τη μοριακή ανάλυση των γονιδίων SRY και AR σε άτομα που παρουσιάζουν διαφόρου βαθμού διαταραχές στη διαφοροποίηση του άρρενος φύλου και αφετέρου με την ανίχνευση ελλειμμάτων στην περιοχή του παράγοντα της αζωοσπερμίας AZF. Μελετήθηκαν συνολικά 198 άτομα: 58 με διαταραχές στη διαφοροποίηση του φύλου και 140 με ανδρική υπογονιμότητα. Πιο αναλυτικά οι ομάδες των υπό μελέτη ατόμων διαχωρίζονται ως εξής: Α) Άτομα με καρυότυπο 46,ΧΥ και διαφόρου βαθμού ελλείμματα στην αρρενοποίηση. Αφορά 51 άτομα: 17 με πλήρες AIS (10 μη συγγενή μεταξύ τους), 24 με μερικό AIS, 7 με PGD (6 μη συγγενή μεταξύ τους) και 3 με μεμονωμένη κρυψορχία. Β) Άτομα με αναστροφή φύλου από θήλυ σε άρρεν. Αφορά τρία φαινοτυπικά άρρενα άτομα με καρυοτύπους 46,ΧΧ (2 άτομα) και 45,ΧΟ (1 άτομο). Γ) Άτομα με μικτούς καρυοτύπους και φαινοτυπικά στίγματα συνδρόμου Turner. Αφορά 4 ασθενείς με καρυοτύπους: 45,ΧΟ/46,ΧΥ και 46,ΧΧ/45,ΧΟ/46,ΧΥ. Δ) Άτομα με φυσιολογικό φαινότυπο άρρενος και καρυότυπο 46,ΧΥ με συνοδό υπογονιμότητα. Αφορά 140 υπογόνιμους άνδρες με αζωοσπερμία (16 άτομα), ολιγοσπερμία (100 άτομα), ολιγοασθενοσπερμία (14 άτομα), ολιγοασθενοτερατοσπερμία (3 άτομα) και σοβαρή ολιγοασθενοτερατοσπερμία ή ολιγοσπερμία (7 άτομα). Η παρουσία του γονιδίου SRY ελέγχθηκε στους 58 ασθενείς των κατηγοριών Α,Β και Γ. Ανίχνευση πιθανών μεταλλάξεων στο γονίδιο SRY έγινε στην ομάδα PGD και στην κατηγορία Γ των ασθενών. Έλεγχος του γονιδίου AR έγινε σε όλα τα άτομα που ήταν υποψήφια για AIS και στους ασθενείς με κρυψορχία. Τα γονίδια SRY και AR μελετήθηκαν, για την HMG-box περιοχή και τα εξόνια 2-8 αντίστοιχα, με PCR και ανάλυση πρωτοταγούς δομής του DNA (sequencing). Η ανίχνευση ελλειμμάτων στον παράγοντα AZF έγινε με εφαρμογή μίας ομάδας τριών πολλαπλών PCR που ανιχνεύουν συνολικά 11 θέσεις. Στο σύνολο των 37 μη συγγενών μεταξύ τους ατόμων, που μελετήθηκαν για το AR γονίδιο, ανιχνεύτηκαν 6 μεταλλάξεις: p.V886M, p.N705S, έλλειμμα του εξονίου 2, p.L881P, p.Q711RfsX787, c.2317-18 T>Α. ........................................................................