Διερεύνηση του ρόλου των επιφυτικών μικροοργανισμών στην αποδόμηση φυτοπροστατευτικών προϊόντων

Abstract

In the present study an effort has been made in order to investigate the role of epiphytic yeasts Rhodotorula glutinis and Rhodotorula rubra in the biodegradation of the insecticides chlorpyrifos, diazinon, lufenuron and teflubenzuron in pure cultures and in plant surfaces, and in particular in tomato fruits. The detection and quantification of the four analytes and their metabolites was successfully achieved in the LC/MS/MS chromatographic system using multiple reactions monitoring (MRM). Τhe analytical methods of determination of the parent compounds and their metabolites from the liquid nutrient medium and tomato fruits were also validated in the LC/MS/MS. The obtained results were acceptable and in accordance with the document SANCO 2007/3131. The results of the biodegradation trials showed biodegradation rates to be proportional with the pesticide concentration and the yeasts’ inoculum. Moreover, the yeasts proved to be more active at 25oC. The presence of glucose in the mineral nutrient medium, as an extra source of carbon, delayed the biodegradation of pesticides by Rhodotorula glutinis. On the contrary, in the case of Rhodotorula rubra higher biodegradation rates were observed in the presence of glucose. Enzymatic assays were applied in order to examine the effect of the insecticides in the enzymes involved in the detoxification of the four insecticides and later the synergists triphenyl phosphate, piperonyl butoxide and diethyl maleate were added in the biodegradation trials. The obtained results indicated esterases to be involved in the biodegradation of chlorpyrifos, glutathione-S-transferases for diazinon and mixed function oxidases with cytochrome P450 for the benzoylureas lufenuron and teflubenzuron. Finally, the biodegradation activity of yeasts was studied on tomato fruits and the insecticide residues were measured by the LC/MS/MS chromatographic system. The decrease of pesticide residues confirmed the results of the biodegradation trials on pure cultures. The results of the present study indicate that the yeasts Rhodotorula glutinis and Rhodotorula rubra could possibly be used successfully for the removal or detoxification of chlorpyrifos, diazinon, lufenuron and teflubenzuron residues in/on vegetables. Moreover, the presence of epiphytic microorganisms should be taken under consideration during the conduction of residue trials setting the preharvest interval.

Στην παρούσα μελέτη διερευνήθηκε η ικανότητα των ζυμών Rhodotorula glutinis και Rhodotorula rubra να αποδομούν τα εντομοκτόνα chlorpyrifos, diazinon, lufenuron και teflubenzuron σε καθαρές καλλιέργειες και φυτικές επιφάνειες και συγκεκριμένα σε καρπούς τομάτας. Η ανίχνευση και ο ποσοτικός προσδιορισμός των φυτοπροστατευτικών προϊόντων και των παραγόμενων μεταβολιτών τους πραγματοποιήθηκε με επιτυχία στο χρωματογραφικό σύστημα LC/MS/MS, με τη χρήση μεταπτώσεων προδρόμου- παραγόμενου ιόντος. Στο σύστημα αυτό αναπτύχθηκαν και επικυρώθηκαν οι αναλυτικές μέθοδοι προσδιορισμού όλων των αναλυτών από το υγρό θρεπτικό υλικό ανάπτυξης των καλλιεργειών και από καρπούς τομάτας. Οι επικυρώσεις έδωσαν και για τα δύο υποστρώματα αποδεκτές τιμές ανακτήσεων και σχετικών τυπικών αποκλίσεων σύμφωνα με το έγγραφο SANCO 2007/3131. Στα πειράματα βιοαποδόμησης παρατηρήθηκε αύξηση της βιοαποδομητικής ικανότητας και των δύο ζυμών αναλογικά με την αύξηση της συγκέντρωσης των φυτοπροστατευτικών προϊόντων και την πληθυσμιακή πυκνότητα κάθε ζύμης. Επιπλέον, οι ζύμες του γένους Rhodotorula αποδείχτηκαν περισσότερο δραστήριες στη θερμοκρασία επώασης των καλλιεργειών στους 25oC. Η ύπαρξη γλυκόζης στο θρεπτικό υλικό αλάτων, ως επιπλέον πηγή άνθρακα, καθυστέρησε τη δράση της Rhodotorula glutinis ως αποδομητή των εντομοκτόνων, ενώ στην περίπτωση της Rhodotorula rubra παρουσία γλυκόζης ο ρυθμός βιοαποδόμησης αυξήθηκε. Με την εφαρμογή ενζυμικών πειραμάτων διερευνήθηκε η επίδραση των εντομοκτόνων στα ενζυμικά συστήματα αποτοξικοποίησης τους, ενώ σε επόμενο στάδιο η προσθήκη των συνεργιστών triphenyl phosphate, piperonyl butoxide και diethyl maleate στα πειράματα βιοαποδόμησης «ενοχοποίησαν» τις εστεράσες για τη βιοαποδόμηση του chlorpyrifos, τις μεταφοράσες της γλουταθειόνης για το diazinon και τις μονοοξυγονάσες, οι οποίες έχουν ως προσθετική ομάδα το κυτόχρωμα P450, για την αποδόμηση των lufenuron και teflubenzuron. Η μείωση των υπολειμμάτων των φυτοπροστατευτικών προϊόντων στους καρπούς τομάτας έπειτα από τον ψεκασμό τους με κύτταρα ζύμης και εντομοκτόνο επιβεβαιώνουν τα αντίστοιχα ευρήματα στο τεχνητό θρεπτικό υλικό. Τα αποτελέσματα της μελέτης υποδεικνύουν πως οι ζύμες Rhodotorula glutinis και Rhodotorula rubra θα μπορούσαν αφενός να χρησιμοποιηθούν με επιτυχία για την απομάκρυνση ή την αποτοξικοποίηση των chlorpyrifos, diazinon, lufenuron και teflubenzuron από τα λαχανικά, αφετέρου θα πρέπει να λαμβάνονται σοβαρά υπόψη κατά τον καθορισμό του χρόνου τελευταίας επέμβασης πριν τη συγκομιδή στα πειράματα υπολειμμάτων.