Γενετική ταυτότητα προγονικών και ώριμων μη-αιμοποιητικών κυττάρων του μυελού των οστών μετά από αλλογενή μεταμόσχευση αιμοποιητικών προγονικών κυττάρων

Abstract

Bone marrow transplantation or stem cell transplantation (SCT) is used to treat a number of hematological disorders. After transplantation recipient’s blood cells are replaced by donor cells. Apart from haematopoeitic cells bone marrow also consists of mesenchymal stem cells (MSC), endothelial progenitor cells (EPC) and fibrocytes. There are no sufficient data showing the origin of these cells after allogenic SCT. In order to investigate whether non-hematopoeitic progenitor cells might are transplantable we isolated MSC, EPC and fibrocytes using specific cell cultures for each cell population and identified their origin (donor/recipient) using a polymerase chain reaction (PCR)-based assay for polymorphic short tandem repeats (STRs). Phenotype of cultured cells was characterized by immunohistochemistry and/or flow cytometry. Using those methods we were able to obtain confluent stromal cell layers, EPC colonies and fibrocytes. Cultured MSC expressed myofibroblastic markers (aSMA) and adhesion molecules including CD44, CD29 and CD105, but lacked expression of hematopoietic (CD34, CD45, CD62) and endothelial markers such as CD31 and vWF. Fibrocytes expressed hematopoietic markers (CD45, CD34low, CD11b, CD13), mesenchymal markers (CD105, CD20, CD44) and typical markers of antigen-presenting cells (HLS-DR, CD80, CD86low). For each patient and at all-time points, STR-PCR analysis showed that cultured EPC and fibrocytes came exclusively from the donor. On the contrary, cultured MSC were of recipient origin. These results demonstrate that EPCs and fibrocytes are transplantable independent of post-transplant time. In contrast, MSC of donor do not engraft at all in recipient’s marrow after allogenic SCT. Based on these results we suggest that BM-cells could be used to reconstitute ischemically damaged tissues through neovascularization and transdifferentiation.

Η αλλογενής μεταμόσχευση μυελού των οστών (ΜΜΟ) αποτελεί θεραπεία εκλογής για ποικίλα αιματολογικά νοσήματα. Εκτός, από το αιμοποιητικό κυτταρικό σύστημα, στο μυελό των οστών ανευρίσκεται και το κυτταρικό σύστημα του στρώματος ή τα μεσεγχυματικά στελεχιαία κύτταρα (ΜΣΚ), καθώς και το αγγειακό σύστημα που αποτελείται κυρίως από τα ενδοθηλιακά κύτταρα. Μια άλλη τάξη προγονικών μη-αιμοποιητικών κυττάρων του μυελού των οστών είναι τα κυκλοφορούντα ινοκύτταρα (ΚΙ), τα οποία συνδέονται με την αποκατάσταση ιστών μετά από βλάβη (tissue repair). Υπάρχουν ενδείξεις ότι τα ΚΙ προέρχονται από τα μονοκύτταρα και στην περίπτωση ιστικής βλάβης διαφοροποιούνται σε ινομυοβλάστες που είναι κύτταρα μεσεγχυματογενούς προέλευσης. Έχοντας ως σκοπό να απαντήσουμε στο αν τα μη-αιμοποιητικά κύτταρα εγκαθίστανται μετά από αλλογενή ΜΜΟ μελετήσαμε την προέλευση των ΜΣΚ, προγονικών ενδοθηλιακών κυττάρων (ΕΠΚ) και ΚΙ σε παιδιά που είχαν υποβληθεί σε ΜΜΟ για αιμοτολογικά νοσήματα. Για την απομόνωση των ΜΣΚ χρησιμοποιήθηκε ανοσομαγνητική επιλογή των CD105(+) κυττάρων και κατόπιν καλλιέργεια αυτών με κατάλληλα θρεπτικά υλικά. Για την απομόνωση των ΕΠΚ και ΚΙ χρησιμοποιήθηκε μέθοδος που βασίζεται στην in vitro διαφοροποίησή τους σε ώριμα ενδοθηλιακά κύτταρα και ινομυοβλάστες, αντιστοίχως, και η οποία πραγματοποιείται με καλλιέργεια μονοπύρηνων κυττάρων σε τρυβλία φιμπρονεκτίνης με κατάλληλο θρεπτικό υλικό. Η φαινοτυπική ταυτότητα των κυττάρων που ελήφθησαν από τις καλλιέργειες προσδιορίσθηκε με ανοσοκυτταροχημικές τεχνικές ή/και κυτταρομετρία ροής. Η γενετική τους ταυτότητα ελέγχθηκε με την αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης (PCR) για την ανάλυση υπερπολυμορφικών γενετικών θέσεων (STRs). Με τις μεθόδους που χρησιμοποιήσαμε ελήφθησαν ομοιογενείς κυτταρικοί πληθυσμοί για κάθε είδος κυττάρων που απομονώθηκε. Όσον αφορά την προέλευση των κυττάρων βρήκαμε ότι τα ΕΠΚ και τα ΚΙ μετά από αλλογενή μεταμόσχευση αιμοποιητικών στελεχιαίων κυττάρων προέρχονται από το δότη. Αντιθέτως, τα ΜΣΚ προέρχονται από το λήπτη. Η κλινική σημασία των αποτελεσμάτων αυτών έγκειται στη δυνατότητα χρησιμοποίησης κυττάρων μυελού των οστών σε νοσήματα που προκαλούν ισχαιμία/νέκρωση ιστών με αποτέλεσμα την επαναγγείωση και την αποτελεσματική διόρθωση της βλάβης (tissue repair).