Περίληψη
Οι 14-3-3 αποτελούν μια οικογένεια ευκαρυωτικών, μικρών σε μοριακό βάρος πρωτεϊνών, με όξινες ιδιότητες, που διαδραματίζουν ρόλο στη ρύθμιση πολλαπλών κυτταρικών διαδικασιών. Η μύγα Drosophila melanogaster περιέχει δύο γονίδια που κωδικοποιούν για ισομορφές 14-3-3 πρωτεϊνών, τα ε και ζ (Leonardo) που κωδικοποιούν για μία και τρεις ισομορφές αντίστοιχα, ενώ στο μαστιγοφόρο παράσιτο Giardia duodenalis εντοπίζεται μόνο ένα γονίδιο. Στην παρούσα εργασία αναφέρουμε την ύπαρξη μιας καινούριας, τρίτης λειτουργικής ισομορφής της πρωτεΐνης LEO, που κωδικοποιείται από το γονίδιο leo και η οποία διαφέρει από τις άλλες δύο σε δομικά και λειτουργικά σημαντικές περιοχές. Έτσι, αυξάνεται η ποικιλομορφία των 14-3-3 στη Drosophila. Επιπλέον, χρησιμοποιήσαμε μια νέα προσέγγιση μείωσης της έκφρασης του leo σε συγκεκριμένες περιοχές με την τεχνική του παρεμβαλλόμενου RNA και δείξαμε διαφορές στην κατανομή της LEO σε κεφάλια ενήλικων μυγών, με την LEOIII να εμφανίζει αυξημένα επίπεδα έκφρασης στους νευρώνε ...
Οι 14-3-3 αποτελούν μια οικογένεια ευκαρυωτικών, μικρών σε μοριακό βάρος πρωτεϊνών, με όξινες ιδιότητες, που διαδραματίζουν ρόλο στη ρύθμιση πολλαπλών κυτταρικών διαδικασιών. Η μύγα Drosophila melanogaster περιέχει δύο γονίδια που κωδικοποιούν για ισομορφές 14-3-3 πρωτεϊνών, τα ε και ζ (Leonardo) που κωδικοποιούν για μία και τρεις ισομορφές αντίστοιχα, ενώ στο μαστιγοφόρο παράσιτο Giardia duodenalis εντοπίζεται μόνο ένα γονίδιο. Στην παρούσα εργασία αναφέρουμε την ύπαρξη μιας καινούριας, τρίτης λειτουργικής ισομορφής της πρωτεΐνης LEO, που κωδικοποιείται από το γονίδιο leo και η οποία διαφέρει από τις άλλες δύο σε δομικά και λειτουργικά σημαντικές περιοχές. Έτσι, αυξάνεται η ποικιλομορφία των 14-3-3 στη Drosophila. Επιπλέον, χρησιμοποιήσαμε μια νέα προσέγγιση μείωσης της έκφρασης του leo σε συγκεκριμένες περιοχές με την τεχνική του παρεμβαλλόμενου RNA και δείξαμε διαφορές στην κατανομή της LEO σε κεφάλια ενήλικων μυγών, με την LEOIII να εμφανίζει αυξημένα επίπεδα έκφρασης στους νευρώνες που είναι υπεύθυνοι για τη μνήμη και τη μάθηση στη Drosophila. Μέρος της διατριβής επίσης αποτελεί μια μελέτη επί της εξέλιξης της οικογένειας των 14-3-3. Οι διάφορες ισομορφές των 14-3-3 πρωτεϊνών εμφανίζουν υψηλό βαθμό συντήρησης μεταξύ των διαφόρων ειδών και διακρίνονται σε δύο ομάδες: α) την τυπική και την β) άτυπη ομάδα. Οι ισομορφές της 14-3-3ζ της Drosophila, ανήκουν στην τυπική ομάδα και η 14-3-3ε στην άτυπη. Η 14-3-3 της Giardia (g14-3-3), εμφανίζει μεγάλη ομολογία σε επίπεδο αλληλουχίας με την 14-3-3ε. Η διαπίστωση των ομοιοτήτων των 14-3-3 σε επίπεδο δομής και αλληλουχίας, μας οδήγησε να διερευνήσουμε την πιθανή λειτουργική συντήρηση των 14-3-3 μεταξύ της Drosophila και της Giardia. Δημιουργήσαμε διαγονιδιακές μύγες που έφεραν το cDNA της g14-3-3 και παράλληλα διαμολύναμε κύτταρα της Giardia με 14-3-3 cDNA της Drosophila. Από τις τρεις διαφορετικές ισομορφές της 14-3-3ζ της Drosophila επιλέξαμε να χρησιμοποιήσουμε το cDNA της LeoI που θεωρείται ως η ευρύτερα εκφραζόμενη στους ιστούς της. Στην εργασία αυτή παρουσιάζονται αποτελέσματα της έκφρασης και της μετα-μεταφραστικής τροποποίησης των πρωτεϊνών στους διαφορετικούς οργανισμούς που εισήχθησαν. Παρά την ικανότητα της Giardia να πραγματοποιεί ορισμένες μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις στις 14-3-3 της Drosophila η αμοιβαία ανάλυση υποδεικνύει πως δεν υφίσταται λειτουργική συντήρηση μεταξύ της δροσοφιλικής 14-3-3ε και της g14-3-3. Το τελευταίο μέρος της παρούσας διατριβής αφορά στη δράση της 14-3-3ζ στις λειτουργίες μάθησης και μνήμης στη μύγα Drosophila melanogaster. Ο σημαντικός ρόλος της 14-3-3ζ στις συγκεκριμένες διαδικασίας έχει αποδοθεί εξαιτίας του υψηλού βαθμού συσσώρευσης στα μανιταροειδή σωμάτια και λόγω του ότι μεταλλαγές που επηρεάζουν τα επίπεδα έκφρασής της εμφανίζουν ελλειμματικό φαινότυπο μάθησης. Θέλοντας να χαρτογραφήσουμε τις ακριβείς περιοχές δράσης της LEO για τη λειτουργία της συνειρμικής εξαρτημένης μάθησης, πραγματοποιήσαμε ιστοειδική σίγηση του γονιδίου με την τεχνική του παρεμβαλόμενου RNA (RNAi). Προς έκπληξή μας, παρατηρήσαμε πως η έλλειψη της LEO από τα μανιταροειδή σωμάτια δεν προκαλούσε ελλειμματικό φαινότυπο μάθησης, αλλά είχε σημαντικές συνέπειες στη διαδικασία μακροπρόθεσμης μνήμης. Αντιθέτως, η έλλειψη της από τους νευρώνες που παράγουν ντοπαμίνη προκαλούσε ελλειμματικό φαινότυπο μάθησης. Περαιτέρω ανάλυση, έδειξε πως ο τελευταίος φαινότυπος συνδεόταν με τη μη φυσιολογική απόκριση των μυγών σε διαδικασίες μη εξαρτημένης μάθησης. Επειδή, η ντοπαμίνη έχει σχετιστεί με ανάλογες συμπεριφορές, προτείνουμε πως ο ελλειμματικός φαινότυπος των μεταλλαγμένων στελεχών, οφείλεται σε διαδικασίες μη εξαρτημένης μάθησης μέσω του βιοχημικού μονοπατιού σύνθεσης ή μεταφοράς της ντοπαμίνης. Πρέπει επίσης να σημειωθεί πως, αν και μέρος της διατριβής, η αρχική υπόθεση της μελέτης της ισοδυναμίας μονομερών και διμερών 14-3-3 πρωτεΐνών στο ΚΝΣ δεν διερευνήθηκε περεταίρω μιας και αρχικά πιλοτικά πειράματα έδειξαν την αδυναμία των μονομερών 14-3-3ζ της Drosophila να αποκαταστήσει τον φαινότυπο θνησιμότητας που προκαλεί η απουσία της αντίστοιχης πρωτεΐνης στη μύγα. Επιπλέον, δείχθηκε πως in vivo και σε συνθήκες ομοιόστασης μεταξύ των διαφορετικών 14-3-3 πρωτεΐνών στη μύγα ο διμερισμός είναι απαραίτητος για τη σταθερότητα και τη λειτουργικότητα της 14-3-3ζ και πως η μονομερής μορφή της είναι ασταθής in vivo και προκαλέι φαινοτύπους αρνητικά επικρατών μεταλλαγών (Messaritou et al., submitted).
περισσότερα
Περίληψη σε άλλη γλώσσα
The 14-3-3 protein family consists of small, acidic proteins found in all eukaryotic organisms studied to date. So far, 14-3-3 proteins have been described to play major roles in regulation of many cellular functions. The genome of the fly, Drosophila melanogaster contains two genes, ε and ζ (Leonardo), that code for one and two 14-3-3 protein isoforms respectively. One the other hand, the genome of a lower eukaryotic organism, the flagellated protozoan Giardia duodenalis has only one such gene. Here, we report the presence of a third, functional 14-3-3 isoform encoded by 14-3-3ζ (Leonardo) gene. This new isoform is divergent from the other two in structurally and functionally significant areas, thus increasing 14-3-3 diversity in Drosophila. Furthermore, we used a novel approach of spatially restricted leo abrogation by RNA-interference and revealed differential LEO distribution in adult brains, with LEOIII increased in neurons essential for learning and memory in Drosophila. Part of ...
The 14-3-3 protein family consists of small, acidic proteins found in all eukaryotic organisms studied to date. So far, 14-3-3 proteins have been described to play major roles in regulation of many cellular functions. The genome of the fly, Drosophila melanogaster contains two genes, ε and ζ (Leonardo), that code for one and two 14-3-3 protein isoforms respectively. One the other hand, the genome of a lower eukaryotic organism, the flagellated protozoan Giardia duodenalis has only one such gene. Here, we report the presence of a third, functional 14-3-3 isoform encoded by 14-3-3ζ (Leonardo) gene. This new isoform is divergent from the other two in structurally and functionally significant areas, thus increasing 14-3-3 diversity in Drosophila. Furthermore, we used a novel approach of spatially restricted leo abrogation by RNA-interference and revealed differential LEO distribution in adult brains, with LEOIII increased in neurons essential for learning and memory in Drosophila. Part of the present thesis, also, is a study in the evolution of 14-3-3 protein family. Different 14-3-3 isoforms appear to be conserved among organisms and they are separated in two major groups: a) the typical and the b) atypical. 14-3-3ζ isoforms of Drosophila, belong in typical group and 14-3-3ε to the atypical. The 14-3-3 protein of Giardia (g14-3-3), appears high sequence similarity with 14-3-3ε. Based on structural and sequence similarity of 14-3-3 proteins we decided to investigate the possible functional conservation of these proteins between Drosophila and Giardia. Thus, we studied transgenic flies carrying cDNA construct of g14-3-3. In parallel, we transfected Giardia cells with cDNA constructs of Drosophila 14-3-3. Between the three different 14-3-3ζ isoforms of Drosophila we chose to use cDNA constructs of LeoI which is considered as the most widely expressed isoform in the fly tissues. In this study, we present data of the expression and post-translational modifications of 14-3-3 proteins exogenously expressed in the different organisms. Although the organism of Giardia is able to post-translationally modify Drosophila 14-3-3 proteins?, our reciprocal analysis reveals that there is no functional conservation present between14-3-3ε of the fly and g14-3-3. The last part of this thesis appeals to the role of 14-3-3ζ in the process of learning and memory in Drosophila melanogaster. The essential role of 14-3-3ζ in these processes has been previously shown, since the protein is highly accumulated in Drosophila mushroom bodies and due to the fact that mutations affecting the protein levels of expression influence the learning behavior of the fly. In order to study the actual place of LEO action in the process of associative learning, we performed experiments of tissuespecific gene silencing by RNA interference (RNAi). To our surprise, we observed that depletion of LEO levels in the mushroom bodies did not affect learning but only long term memory processes. On the contrary, depletion of LEO expression in dopaminergic neurons caused defective learning phenotype. Further analysis, revealed that this phenotype was actually an effect of defective non associative learning processes. The neurotransmitter dopamine has been previously reported to play role in such behaviors; we suggest that the defective phenotype of the mutated strains is related with non associative processes via the biochemical pathway of dopamine synthesis or transport. Finally we have to mention that, although part of the thesis, the initial hypothesis of functional equivalence between monomeric and dimeric forms of 14-3-3 proteins in the CNS was not studied further since initial experiments revealed that monomeric 14-3-3 forms could not rescue lethality of 14-3-3ζ mutant flies. Moreover, it has been shown in vivo that 14-3-3ζ dimerisation is essential for the stability and proper function of the protein. Monomeric forms of 14-3-3ζ are not stable in vivo and they cause dominant negative mutations (Messaritou et al., submitted).
περισσότερα