Αλληλεπίδραση της πρωτεϊνικής επικράτειας Α1 του παράγοντα πήξης του αίματος von Willebrand με την μεμβρανική πρωτεΐνη Α του χρυσίζοντος σταφυλόκκοκου: θεωρητική και πειραματική προσέγγιση

Abstract

In the present thesis is investigated the interaction of domain D of S. aureus Protein A (SpaD) with domain A1 of von Willebrand factor onto biofunctionalized scaffolds -experimentally as well as with molecular dynamic techniques. SpaD was cloned in pAN5 plasmid, expressed, in vivo biotinylated by AVB101 E.coli strain and immobilized onto cellulose acetate scaffolds by using biotin-streptavidin strategies. The effectiveness of the functionalization of the scaffolds was tested with the immobilization of biotinylated green fluorescent protein (GFP) and its direct visualization with confocal fluorescence microscopy. The scaffolds were subsequently incubated with S. aureus culture with or without the presence of A1 domain of vWF. The non-adherent properties of the resulting scaffolds were examined with scanning electron microscopy (SEM). The exact configuration of interaction of A1 and SpaD was further elucidated by using molecular dynamics and docking techniques. Six putative configurations were modeled and equilibrated for 10 ns. The interaction energies and inter-protein distances were measured in order to identify the possible configuration of interaction. The interaction site of A1 consists of two antiparallel beta sheets (b2 and b3) and part of an α-helix, resembling the interaction interface of SpaD with IgM. In addition mutants of SpaD exhibiting decreased binding to A1, as determined experimentally, were modeled based on the putative complex of SpaD-A1 interaction. The resulting mutant manifests considerable higher interaction energy with A1 and significant translation and rotation in comparison to the wild type. Furthermore, the denaturing effect of urea and high temperature on A1, A2 and A3 domain of von Willebrand factor was investigated in order to elucidate the mechanism of lethal hemorrhages occurring in case of renal failure. The extent of denaturation was estimated by structural parameters as helical/beta sheet content, native contacts and RMSD. A1 manifests significant resistance to the denaturing effect of both heat and urea, whereas A2 and A3 exhibit considerable denaturation. The cleavage site of A2 domain for ADAMTS13 is exposed after 16 ns of simulation time. The intermediate states of the pathway of denaturation were determined making use of the principal component analysis technique. Urea induces an additional loss of secondary structure and a considerable increase of total protein energy in comparison to heat alone. The study of urea induced denaturation and solubility of proteins in aqueous urea solutions was based on the investigation of the behaviour of the N-terminal 1-57 peptide of HPNAP protein of Helicobacter pylori in urea solutions of variable potency. A considerable amount of the simulations has been carried out on the Southeastern European Grid making use of a parallel running version of NAMD molecular simulation package. A detail protocol concerning the workflow of preparation, submission and collection of simulation data has been developed to this end.

Στην προκείμενη διατριβή μελετάται η αλληλεπίδραση της επικράτειας D της πρωτεΐνης Α του S. aureus με την επικράτεια Α1 του παράγοντα πήξης του αίματος von Willebrand (vWF) επί βιολειτουργικών ικριωμάτων. Η μελέτη αυτή περιέλαβε τόσο πειραματικό μέρος όσο και θεωρητικό, κάνοντας χρήση μεθόδων προσομοιώσεων μοριακής δυναμικής. Η επικράτεια SpaD κλωνοποιήθηκε στο πλασμίδιο pAN5, εκφράστηκε, βιοτινυλιώθηκε in vivo στο στέλεχος του E.coli AVB101 και εν συνεχεία καθηλώθηκε σε ικριώματα οξικής κυτταρίνης κάνοντας χρήση της τεχνικής βιοτίνης-στρεπταβιδίνης. Η αποτελεσματικότητα της μετατροπής των ικριωμάτων σε λειτουργικά επιβεβαιώθηκε με την καθήλωση επί αυτών της πράσινης φθορίζουσας πρωτεΐνης (GFP) και την ανίχνευση της με την χρήση μικροσκοπίας φθορισμού. Τα ικριώματα εν συνεχεία επωάστηκαν με καλλιέργεια S. aureus με ή χωρίς την παρουσία της επικράτειας Α1. Οι αντι-προσκολλητικές ιδιότητες των βιολειτουργικών ικριωμάτων και η αλληλεπίδραση του S. aureus με τα ικριώματα οξικής κυτταρίνης μελετήθηκαν με την χρήση ηλεκτρονικής μικροσκοπίας σάρωσης (SEM) με άμεση απεικόνιση των σταφυλοκοκκικών αποικιών. Η ακριβής διάταξη αλληλεπίδρασης της SpaD και της επικράτειας Α1 προσδιορίστηκε με την χρήση τεχνικών μακρομοριακού ελλιμενισμού και μοριακής δυναμικής. Έξι πιθανά σύμπλοκα SpaD - Α1 μοντελοποιήθηκαν και εξισορροπήθηκαν για 10 ns. Οι ενέργειες αλληλεπίδρασης και οι διαπρωτεϊνικές αποστάσεις υπολογίστηκαν με σκοπό τον προσδιορισμό της πιθανότερης διάταξης αλληλεπίδρασης. Η περιοχή αλληλεπίδρασης της επικράτειας Α1 αποτελείται από 2 αντιπαράλληλα β-φύλλα (β2 και β3) και τμήμα παρακείμενης α-έλικας. Η περιοχή αυτή προσομοιάζει στην διεπιφάνεια αλληλεπίδρασης SpaD-IgM. Επιπλέον, μεταλλαγμένες δομές της SpaD (οι οποίες όπως έχει προσδιοριστεί πειραματικά εμφανίζουν μειωμένη αλληλεπίδραση με την Α1 επικράτεια) μοντελοποιήθηκαν με βάση την πιθανή διάταξη αλληλεπίδρασης SpaD-Α1. Η μεταλλαγμένη SpaD παρουσιάζει σημαντικά υψηλότερη ενέργεια αλληλεπίδρασης με την Α1 συγκριτικά με την αγρίου τύπου. Πέραν τούτου, η μετουσιωτική ισχύς της ουρίας και της υψηλής θερμοκρασίας επί των επικρατειών Α1, Α2 και Α3 διερευνήθηκε με την χρήση τεχνικών προσομοιώσεων μοριακής δυναμικής με σκοπό να διασαφηνιστεί ο μηχανισμός αποδιάταξης τους και να ερμηνευτεί το φαινόμενο των θανατηφόρων αιμορραγιών στην περίπτωση της νεφρικής ανεπαρκείας (κλινική κατάσταση που συνοδεύεται από υψηλή τιμή ουρίας πλάσματος). Ο βαθμός της μετουσίωσης εκτιμήθηκε βάσει δομικών παραμέτρων όπως το περιεχόμενο α-έλικας και β-φύλλου, ο αριθμός τοπικών επαφών και η τιμή του RMSD. Η επικράτεια Α1 επιδεικνύει αξιοσημείωτη αντίσταση στην μετουσιωτική ισχύ τόσο της ουρίας όσο και της θερμότητας σε αντίθεση με τις επικράτειες Α2 και Α3 που παρουσιάζουν σημαντική μετουσίωση. Η θέση κοπής της Α2 επικράτειας για την ADAMTS13 εκτίθεται μετά από 16 ns προσομοίωσης. Οι ενδιάμεσες καταστάσεις του μονοπατιού της μετουσίωσης προσδιορίστηκαν με την χρήση της ανάλυσης κυρίων συνιστωσών. H σπουδή της μετουσίωσης των πρωτεϊνών υπό την επίδραση της ουρίας βασίστηκε στην μελέτη του αμινοτελικού άκρου του μονομερούς της πρωτεΐνης HPNAP του H.Pylori σε διαλύματα ουρίας διαφόρων συγκεντρώσεων. Ένα σημαντικό μέρος των προσομοιώσεων αυτής της διατριβής πραγματοποιήθηκαν στο νοτιοανατολικό ευρωπαϊκό υπολογιστικό πλέγμα με την χρήση του λογισμικού προσομοιώσεων μοριακής δυναμικής NAMD και συγκεκριμένα την έκδοση του για διενέργεια προσομοιώσεων σε πολυπύρηνη δικτυακή επεξεργαστική πλατφόρμα. Για τον σκοπό αυτό αναπτύχθηκε ένα διάγραμμα ροής και ένα πρωτόκολλο για την προετοιμασία, υποβολή και συλλογή των αρχείων της προσομοίωσης.