Διερεύνηση των μηχανισμών ογκογένεσης σε προκαρκινικές και καρκινικές αλλοιώσεις της στοματοφαρυγγικής κοιλότητας: ανάλυση του ρόλου των ιϊκών λοιμώξεων

Abstract

Studies on the participation of human papillomavirus (HPV) and human herpesviruses (HHVs) in the initiation and progression of oral neoplasia have generated conflicting results. The observed discrepancy is mainly attributable to the varying sensitivity of applied methodologies and to specific epidemiologic parameters of the examined populations. In order to evaluate the role of viral infections in oral carcinogenesis, we analyzed 53 potentially malignant and malignant oral lesions, consisting of 29 cases of hyperplasia, 5 cases of dysplasia and 19 squamous cell carcinomas (SqCCs), as well as 25 oral scrapes derived from healthy individuals, by a highly sensitive polymerase chain reaction (PCR)- based experimental protocol. Diverse scientific issues were addressed with the use of type- specific (TS) PCR, restriction fragment length polymorphism (RFLP) analysis, dot blotting, non-isotopic in situ hybridization (NISH) and immunohistochemistry. The presence of HPV-DNA was detected in 48 (91%) pathologic specimens vs. 2 (8%) normal controls (pO.OOl) via nested (N) PCR analysis. To the best of our knowledge, this is the highest infection rate ever reported in pathologic oral tissues. Positivity for HPV was independent of histology and smoking habits of the examined group of patients. At least one “high-risk” viral type, such as HPV 16, 18 and 33, was identified by TS-PCR in 47 (98%) infected specimens, while only 1 SqCC was solely infected by a “low-risk” type (HPV6). HPV 16 was the prevailing viral type, being present in 71% of positive cases. Single HPV 16 and 18 infections were confirmed by RFLPs. Notably, HPV58 was detected by dot blotting in 3 hyperplastic lesions. The physical status of the virus was evaluated by NISH. Diffuse (type 1) and punctate (type 2) signals, indicative of the episomal and integrative pattern of HPV infection, were noted for low- and high-risk types, respectively. The aforementioned findings are clearly suggestive of an early involvement of high-risk HPV types in oral carcinogenesis. As far as the study of HHVs is concerned, PCR analysis revealed the presence of herpesviral genomic sequences in 30 (57%) pathologic vs. 8 (32%) normal samples (p=0.042). With the exception of Epstein-Barr virus (HHV4), there was no correlation between herpesviral DNA detection and the histological diagnosis or the remaining clinicopathological characteristics of the patients. The HHV4 genome was identified in 11 (21%) oral lesions vs. 1 (4%) normal control (p=0.056), a difference that points towards a “trend” of HHV4 contribution to the development of premalignant and malignant oral manifestations. Furthermore, we observed a gradual, yet non-significant, increase in HHV4 infection rate accompanying the histological transition from hyperplasia to SqCC. The pattern of infection in positive specimens was investigated viaimmunostaining for the viral proteins LMP-1 and BZLF-1, which represent key products of the latent and immediate-early productive states of HHV4, respectively. Statistical analysis exposed a highly significant induction of the epithelial expression of LMP-1 in precancerous (dysplastic) and cancerous lesions in comparison to potentially neoplastic (hyperplastic) ones (p=0.004). In view of the well-documented oncogenic activity of LMP- 1, this observation supports an active role of HHV4 in oral cancer. Moreover, the coexpression of both viral products in the tumor nests of SqCCs implies the lack of discrete “latent” and “replicative” neoplastic cell populations. The frequent detection (16%) of herpes simplex 1 (HHV1) DNA in normal oral scrapes, which reflects the high prevalence of the virus in the general population, as well as the absence of genomic sequences of varicella-zoster virus (HHV3), human cytomegalovirus (HHV5) and HHV7 from the healthy control group, should also be stressed. Finally, infection of the oral cavity by Kaposi's-sarcoma associated herpesvirus (HHV8) seems to represent a more common phenomenon than previously reported, at least in the examined population. Overall, viral infections were demonstrated in every (100%) oral lesion vs. 36% of normal samples (pO.OOl). This finding, along with the regularly observed co-infections, such as those between HPV/HFIV1-2, HPV/HHV4 and HPV/HHV8, suggest a direct participation and, perhaps, a synergistic action of the implicated viruses in oral proliferative conditions.

Η διεθνής βιβλιογραφία που αφορά τη συμμετοχή του ιού του ανθρωπίνου θηλώματος (human papillomavirus ή HPV) και των ανθρωπίνων ερπητοϊών (human herpesviruses ή HHVs) στην αιτιοπαθογένεση του καρκίνου της στοματοφαρυγγικής κοιλότητας (σ.κ.) διέπεται από αντικρουόμενα αποτελέσματα. Η παρατηρούμενη ασυμφωνία στη συχνότητα ιικής ανίχνευσης μεταξύ των διαφόρων μελετών οφείλεται πιθανότατα στην κυμαινόμενη ευαισθησία των εφαρμοζόμενων μεθόδων και στα ιδιαίτερα επιδημιολογικά χαρακτηριστικά των εξεταζόμενων πληθυσμών. Προκειμένου να αξιολογήσουμε το ρόλο των ιικών λοιμώξεων στην καρκινογένεση της σ.κ. αναλύσαμε πενήντα τρεις (53) “εν δυνάμει καρκινικές” και καρκινικές αλλοιώσεις αποτελούμενες από 29 υπερπλασίες, 5 δυσπλασίες και 19 πλακώδη καρκινώματα (squamous cell carcinomas ή SqCCs), σε αντιπαραβολή με 25 στοματικά επιχρίσματα υγιών μαρτύρων, μέσω μεθοδολογίας υψηλής ευαισθησίας βασισμένης στην αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης (PCR). Επιπλέον, για τη διευκρίνιση επιμέρους ερευνητικών ζητημάτων χρησιμοποιήθηκαν οι τεχνικές της ειδικής για κάθε ιικό τύπο (type-specific ή TS) PCR, της ανάλυσης πολυμορφισμών κλασμάτων DNA (restriction fragment length polymorphism ή RFLP), του στυπώματος σε κηλίδα (dot blotting), του μη ραδιενεργού in situ υβριδισμού και της ανοσοϊστοχημείας. Η παρουσία του γενώματος του HPV ταυτοποιήθηκε σε 48 (91%) παθολογικά δείγματα έναντι 2 (8%) υγιών μαρτύρων (γκΟ,ΟΟΙ) μέσω ανάλυσης ενισχυμένης (nested) PCR. Πρόκειται για το υψηλότερο ποσοστό μόλυνσης αλλοιώσεων της σ.κ. από HPV που έχει καταγραφεί μέχρι σήμερα. Η θετικότητα για τον ιό ήταν ανεξάρτητη της ιστολογικής διάγνωσης και των καπνιστικών συνηθειών των ασθενών. Τουλάχιστον ένας τύπος υψηλού κινδύνου (“high risk”), όπως οι HPV16, 18 και 33, εντοπίστηκε σε 47 (98%) μολυσμένα δείγματα μέσω TS-PCR, ενώ μόνο 1 (2%) SqCC εμφάνισε απλή μόλυνση από τύπο χαμηλού κινδύνου (“low risk”), τον HPV6. Ο HPV16 ήταν ο κυρίαρχος ιικός τύπος, με την παρουσία του να ταυτοποιείται στο 71% των θετικών περιπτώσεων. Οι απλές μολύνσεις από HPV16 και 18 επιβεβαιώθηκαν μέσω RFLPs. Αξιοσημείωτη είναι η παρουσία του HPV58, στελέχους υψηλής ογκογενετικής ικανότητας, σε τρεις (3) υπερπλαστικές βλάβες βάσει των αποτελεσμάτων του στυπώματος σε κηλίδα. Το πρότυπο μόλυνσης στις θετικές αλλοιώσεις διερευνήθηκε μέσω in situ υβριδισμού. Διάχυτο σήμα (τύπου 1), ενδεικτικό επισωματικής λοίμωξης, και στικτό σήμα (τύπου 2), αντιπροσωπευτικό ιικής ενσωμάτωσης στο γένωμα του ξενιστή, παρατηρήθηκαν σε περιστατικά φέροντα τύπους χαμηλής και υψηλής επικινδυνότητας, αντίστοιχα. Τα ανωτέρω ευρήματα υποστηρίζουν την πρώιμη συμμετοχή “high risk” HPV στελεχών στην καρκινογένεση της σ.κ. Όσον αφορά τη μελέτη των HHVs, η ανάλυση PCR ανέδειξε την παρουσία ερπητικών γενωμικών αλληλουχιών σε 30 (57%) παθολογικά υλικά έναντι 8 (32%) φυσιολογικών μαρτύρων (ρ=0,042). Με εξαίρεση την παρουσία του ιού Epstein- Barr (HHV4), δεν ανιχνεύθηκε συσχέτιση μεταξύ της συχνότητας ανίχνευσης ερπητοϊών και της ιστολογικής εικόνας ή των λοιπών κλινικοπαθολογικών παραμέτρων της ομάδας ασθενών. To DNA του HHV4 ταυτοποιήθηκε σε έντεκα (21%) αλλοιώσεις έναντι μόλις ενός (4%) φυσιολογικού μάρτυρα (γ>=0,056), διαφορά ενδεικτική “τάσης” συμμετοχής του ιού στις νεοεπεξεργασίες της σ.κ. Παράλληλα, παρατηρήθηκε βαθμιαία αύξηση, παρότι μη σημαντική, στο ποσοστό μόλυνσης από HHV4 κατά τη μετάβαση από την υπερπλασία στο SqCC. Ο τύπος της λοίμωξης διαπιστώθηκε μέσω ανοσοϊστοχημικής ανάλυσης των θετικών αλλοιώσεων για τις πρωτεΐνες LMP-1 και BZLF-1 της λανθάνουσας και πρώιμης παραγωγικής φάσης του ιού, αντίστοιχα. Η στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων • κατέδειξε μία σημαντική επαγωγή της επιθηλιακής έκφρασης της ογκοπρωτεΐνης LMP-1 στις προκαρκινικές (δυσπλαστικές) και καρκινικές αλλοιώσεις σε σχέση με τις “εν δυνάμει καρκινικές” (υπερπλαστικές) βλάβες (ρ=0,004), αποτέλεσμα που συνηγορεί υπέρ του ενεργού ρόλου του ιού στην καρκινογένεση. Επιπλέον, η συνέκφραση των 2 ιικών πρωτεϊνών στις καρκινικές βλάστες των SqCCs υποδηλώνει την απουσία διακριτών “λανθανόντων” και “λυτικών” νεοπλασματικών κυτταρικών πληθυσμών. Αναφοράς χρήζει και η συχνότερη παρουσία του ιού του επιχειλίου έρπητα (HHV1) στα φυσιολογικά επιχρίσματα έναντι των παθολογικών υλικών, ενδεικτική του υψηλού επιπολασμού του ιού στο γενικό πληθυσμό, καθώς και η πλήρης απουσία γενωμικών αλληλουχιών του ιού της ανεμοβλογιάς (HHV3), του κυτταρομεγαλοϊού (HHV5) και του έρπητα 7 (HHV7) από τους υγιείς μάρτυρες. Τέλος, η μόλυνση της σ.κ. από τον ιό του σαρκώματος Kaposi (HHV8) φαίνεται να αποτελεί, στον υπό ανάλυση πληθυσμό, συνηθέστερο γεγονός από ότι βιβλιογραφικά αναφέρεται. Συνολικά, ιική λοίμωξη αποκαλύφθηκε στο σύνολο (100%) των αλλοιώσεων έναντι μόλις 36% των μαρτύρων (γ?<0,001), εύρημα που σε συνδυασμό με τις σημειωθείσες συμμολύνσεις, με επικρατέστερες αυτές μεταξύ HPV/HHV1-2, HPV/HHV4 και HPV/HHV8, υποστηρίζει τη συμμετοχή και πιθανή συνέργεια των εμπλεκόμενων ιών στις νεοεπεξεργασίες της σ.κ.