Ανάπτυξη και μελέτη νέων χημειοφωταυγειομετρικών αναλυτικών τεχνικών

Abstract

This doctorial thesis is mainly focused on the study of new chemiluminescent reactions by the use of a batch system together with some variations of flow systems. By the use of a batch system for the prelimenary studies and the flow systems for further development, the possibilities to minimize the required time to attain the optimum conditions for the examined chemiluminogenic reactions, are considered. Also, several experiments are made in order to find new electrogenerated chemiluminescent reactions. The theoritacal part of this thesis presents the following subjects: A sort historicak review of chemiluminescence phenomena from ancient times until today. The principals and theoretical basis of chemiluninescence. The instrumentation which is used and optimazation of experimental parameters in chemiluminescent systems. A systymatic aproach of chemiluminescent reactions according with their common characteristics. Development of new chemiluminescent systems by the synthesis of new chemiluminescent probes. Applications of chemiluminescent reactions and a sort discuss about the benefits of chemiluminescent techniques over others optical techniques. The experimental part of this thesis deals with the following topics: A brief description of the instrumentation that is used during the elaboration of this thesis, which is consisted of a batch chemiluminometer, a continious flow and two flow injection analyzers and a photometer of electrogenerated chemiluminescence (chapter 2). The reactions of bilirubin with saome inorganic oxidants that lead to the emission of radiation. The ractions of bilirubin with sodium hypochlorite and N-bromosuccinimide are optimised, firstly with the batch chemiluminometer and after that with the continious flow and flow injection apparatus. It was found that the experimental parameters that affect the optimum conditions for every chemiluminescent reaction are similar between the several apparatus that were used. On the other hand, especially when the reactions are very fast, some parameters need to be reconsidered. The batxh system was found to have lower limits of detections, but the flow through systems had better repeatability. The reactions of bilirubin with these oxidants can not be used for the measurment of the analyte in real samples, because the alboumin, which usually coexists with bilirubin, emitts radiation under the same conditions (chapter 3). The effect of bilirubin oxidase on louminol, which results the emission of strong radiation from the reaction mixture. This radiation is reduced if bilirubin is added in the reaction mixture. This reduction in the emission can be used for the measurement of bilirubin, and the experimental parameters that affect this reduction are thoroughly examined. This methed presents very low detection limits (chapter 4). The behaviour of several compounds as for the emission of radiation, when they are examined in the electrogenerated chemiluminescent apparatus. Apart from louminol, which, as it was expected, emitts radiation, the other compounds that were tested did not emitt or emitted very weak radiation (chapter 5). The chemiluminometric method for the determination of trimetazidine in bilogical fluids and commercial formulations. The method is based on the chemiluminogenic reaction of trimetazidine with potassium permaganate in acid media. Acidic medium is established by polyphosphoric acid which enhances extensively the emission intensity, in comparisson with thw other common used acids. The method was developed with the batch system and reveal very low detection limit. Common excipients do not interfere severely an trimetazidine can be determined succesfully in commercial formulations. After extaction of trimetazidine from the real sample, the method can also be used in samples of serum and urine (chapter 6). The chemiluminescent behaviour of terbium (III). It was found that terbium (III) enhances the radiation which is emitted by the action of sodium ferricyanide on louminol, in alkaline media. This behaviour is also presented by several other metals, so the usefulness of this observation is limmited (chapter 7).

Η διατριβή αυτή επικεντρώθηκε κυρίως στη μελέτη νέων χημειοφωταυγών αντιδράσεων χρησιμοποιώντας ένα στατικό σύστημα και παραλλαγές συστημάτων ροής. Εκτιμήθηκαν οι δυνατότητες μείωσης του απαιτούμενου χρόνου για την εύρεση των βέλτιστων συνθηκών των αντιδράσεων αυτών, χρησιμοποιώντας το στατικό σύστημα για τις προκαταρκτικές μελέτες και τα συστήματα ροής για περαιτέρω εφαρμογή. Επίσης, έγινε προσπάθεια για την εύρεση νέων αντιδράσεων ηλεκτροπαραγόμενης χημειοφωταύγειας. Στο θεωρητικό μέρος της διατριβής αυτής, γίνεται συνοπτική αναφορά στα παρακάτω σημεία: Σύντομη ιστορική αναδρομή του φαινομένου της χημειοφωταύγειας από την αρχαιότητα ως τις ημέρες μας. Θεμελειώδεις θεωρητικές έννοιες στις οποίες βασίζεται το φαινόμενο της χημειοφωταύγειας. Οργανολογία που χρησιμοποιείται και τρόποι βελτίωσης πειραματικών παραμέτρων σε φωτόμετρα χημειοφωταύγειας. Κατάταξη αντιδράσεων χημειοφωταύγειας που λαμβάνουν χώρα σε διαλύματα σε κατηγορίες ανάλογα με τα κοινά χαρακτηριστικά που παρουσιάζουν. Προοπτικές χημειοφωταύγειας μέσω της σύνθεσης νέων χημειοφωταυγών μορίων. Εφαρμογές αντιδράσεων χημειοφωταύγειας και πλεονεκτήματά της έναντι άλλων οπτικών τεχνικών. Στο πειραματικό μέρος της διατριβής περιγράφονται αναλυτικά τα παρακάτω: Η οργανολογία που χρησιμοποιήθηκε κατά την εκπόνηση της διατριβής αυτής και η οποία αποτελείται από ένα στατικό φωτόμετρο, ένα φωτόμετρο συνεχούς ροής, δύο παραλλαγές συστήματος εισαγωγής δείγματος σε ροή, και ένα φωτόμετρο συνεχούς ροής ηλεκτροπαραγόμενης χημειοφωταύγειας (κεφάλαιο 2). Η μελέτη των αντιδράσεων της χολερυθρίνης με διάφορα ανόργανα οξειδωτικά που οδηγούν σε εκπομπή χημειοφωταύγειας. Οι αντιδράσεις της με το υποχλωριώδες νάτριο και το Ν-βρωμοηλεκτριμίδιο μελετήθηκαν διεξοδικά, αρχικά στο στατικό φωταυγειόμετρο και στη συνέχεια στα φωταυγειόμετρα ροής και εξάχθηκαν συμπεράσματα ως προς τις βέλτιστες συνθήκες κάτω από τις οποίες λαμβάνουν χώρα, σε κάθε σύστημα. Διαπιστώθηκε, έτσι, ότι οι παράμετροι που επηρεάζουν τις βέλτιστες συνθήκες κάθε χημειοφωταυγούς αντίδρασης είναι συγκρίσιμες ανάμεσα στο στατικό φωτόμετρο και στα συστήματα συνεχούς ροής. Από την άλλη πλευρά όμως κάποιοι παράγοντες χρειάζεται να μελετηθούν εκ νέου, ιδιαίτερα όταν η εξεταζόμενη αντίδραση είναι πολύ γρήγορη. Το στατικό σύστημα εμφανίζει χαμηλότερα όρια ανίχνευσης, ενώ από την άλλη πλευρά, τα συστήματα ροής υπερτερούν στην επαναληψιμότητα. Η επίδραση της αλβουμίνης (η οποία παράγει χημειοφωταύγεια κάτω από τις ίδιες συνθήκες), περιορίζει τις δυνατότητες αξιοποίησης της αντίδρασης για τον προσδιορισμό της χολερυθρίνης σε πραγματικά δείγματα (κεφάλαιο 3). Η μελέτη της επίδρασης της οξειδάσης της χολερυθρίνης στη λουμινόλη, που έχει ως αποτέλεσμα την εκπομπή ακτινοβολίας. Η ισχύς της ακτινοβολίας αυτής μειώνεται με την προσθήκη χολερυθρίνης. Η ελάττωση αυτή μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τον προσδιορισμό της χολερυθρίνης και οι διάφοροι παράγοντες που επηρεάζουν το φαινόμενο αυτό παρουσιάζονται αναλυτικά. Η μέθοδος παρουσιάζει πολύ χαμηλά όρια ανίχνευσης, αλλά η εφαρμογή της σε πραγματικά δείγματα δεν έδωσε ικανοποιητικά αποτελέσματα (κεφάλαιο 4). Η μελέτη της συμπεριφοράς διαφόρων ενώσεων ως προς την παραγωγή ηλεκτροπαραγόμενης χημειοφωταύγειας. Εκτός από τη λουμινόλη, η οποία όπως αναμενόταν παρήγαγε ακτινοβολία, οι περισσότερες ενώσεις που δοκιμάστηκαν δεν έδωσαν ή έδωσαν πολύ ασθενή ακτινοβολία (κεφάλαιο 5). Η ανάπτυξη χημειοφωταυγειομετρικής μεθόδου για τον προσδιορισμό τριμεταζιδίνης σε βιολογικά υγρά και φαρμακευτικά σκευάσματα με βάση τη χημειοφωταυγή αντίδραση αυτής με το υπερμαγγανικό κάλιο σε όξινο περιβάλλον. Οι όξινες συνθήκες εξασφαλίζονται με τη χρήση πολυφωσφορικού οξέος, το οποίο αποδείχτηκε ότι προκαλεί εκπομπή πολύ ισχυρότερης ακτινοβολίας, από αυτή που προκαλούν τα συνήθως χρησιμοποιούμενα οξέα. Η μέθοδος αναπτύχθηκε με τη χρήση του στατικού συστήματος, το οποίο παρουσίασε πολύ χαμηλό όριο ανίχνευσης. Οι παρεμποδίσεις από τα συνήθη έκδοχα που χρησιμοποιούνται σε φαρμακευτικά σκευάσματα του εμπορίου είναι περιορισμένες, γεγονός που επιτρέπει τον προσδιορισμό της τριμεταζιδίνης σε αυτά. Επίσης, είναι δυνατός ο προσδιορισμός της τριμεταζιδίνης σε δείγματα ορού και ούρων με ικανοποιητική ακρίβεια, αν προηγηθεί εκχύλισή της (κεφάλαιο 6). Η μελέτη της χημειοφωταυγούς συμπεριφοράς του τερβίου (ΙΙΙ). Διαπιστώθηκε ότι το τέρβιο (ΙΙΙ) ενισχύει την ακτινοβολία που εκπέμπεται από την αντίδραση της λουμινόλης με το σιδηρικυανιούχο κάλιο σε αλκαλικό περιβάλλον. Η ενίσχυση της ακτινοβολίας που προκαλείται είναι πιθανότατα καταλυτικής φύσης, καθώς δε διαπιστώθηκε σχηματισμός κάποιου συμπλόκου του τερβίου (ΙΙΙ). Η ανάλογη συμπεριφορά που παρουσιάζουν διάφορα άλλα μέταλλα στις ίδιες συνθήκες περιορίζει τη χρησιμότητα αυτών των παρατηρήσεων (κεφάλαιο 7).