Πρωτεομική ανάλυση κυτταρικών συστημάτων καρκίνου του παχέος εντέρου

Abstract

Mutation of RAS genes is one of the most common genetic alterations contributing to cancer development. For colorectal cancer in particular, activating RAS mutations are very common and contribute in the progression of adenoma to carcinoma. KRAS is mutated at early stages, after mutations in tumor suppressor genes, such as APC, have occured. RAS proteins are members of the family of small GTPases and cycle between an inactive, GDP-bound and an active, GTP-bound conformation. Mutations of these genes generate constitutively active proteins that stimulate signaling pathways regulating diverse cellular processes, such as proliferation, apoptosis, motility, etc. In this study, we sought to identify changes in the proteome of the Caco2 colon adenocarcinoma cell line induced by the expression of two distinct RAS oncogenes, Kirsten- and Harvey-RAS, in their mutated, constitutively active forms (KRASV12 and HRASV12 respectively). Protein extracts from two pairs of samples, Caco2 vs Caco2- KRASV12 and Caco2 vs Caco2-HRASV12 were subjected to two dimensional electrophoresis. Approximately 200 differentially expressed proteins were identified by LC-MS/MS. While many of them were unique to each expressed oncogene, there were also substantial similarities. Interestingly, transformation by mutant KRASV12 resulted in elevated expression levels and activity of endogenous, wild type HRAS. Silencing the latter with a specific siRNA reversed several proteomic changes observed in KRASV12-transformed cells, suggesting that oncogenic KRAS partly exerts its effects through endogenous HRAS activation. The involvement of the MAPK pathway downstream of HRAS activation was confirmed with the use of specific pathway inhibitors. Finally, HRAS siRNA reversed the KRASV12-induced changes in the expression of cytoskeletal and cell adhesion proteins and resulted in a reduction of the invasive potential of transformed cells. Our data reveal a novel interplay between KRAS and HRAS with interesting implications for colorectal carcinogenesis

Οι μεταλλάξεις στα γονίδια RAS είναι από τις πιο συχνές γενετικές μεταβολές που παρατηρούνται στην ανάπτυξη και την πρόοδο του καρκίνου. Ειδικότερα στον καρκίνο του παχέος εντέρου, το ογκογονίδιο KRAS μεταλλάσσεται στα αρχικά στάδια της νόσου και αφού έχουν προηγηθεί μεταλλάξεις και απενεργοποίηση ογκοκατασταλτικών γονιδίων, όπως το APC. Οι RAS πρωτεΐνες ανήκουν στην οικογένεια των μικρών GTPασών και εναλλάσσονται μεταξύ μιας ανενεργής (που προσδένει το GDP) και μιας ενεργής (που προσδένει το GTP) μορφής. Οι μεταλλάξεις του γονιδίου οδηγούν συνήθως σε πρωτεΐνη που βρίσκεται συνεχώς στην ενεργή μορφή και ενεργοποιεί σηματοδοτικά μονοπάτια που ελέγχουν τον πολλαπλασιασμό, την απόπτωση και άλλες κυτταρικές λειτουργίες. Στην παρούσα μελέτη, αναζητήθηκαν οι αλλαγές που προκαλούν τα ογκογονίδια KRASV12 και HRASV12 στο πρωτεομικό προφίλ της Caco2, μιας κυτταρικής σειράς αδενοκαρκινώματος του παχέος εντέρου που δεν φέρει μεταλλάξεις στους γενετικούς τόπους των RAS. Η έκφραση των δύο ογκογονιδίων οδήγησε στη δημιουργία δύο νέων κυτταρικών σειρών, Caco2-KRASV12 και Caco2-HRASV12. Η σύγκριση των πρωτεομικών προφίλ των τριών κυτταρικών σειρών έγινε με ηλεκτροφόρηση δύο διαστάσεων και στη συνέχεια ταυτοποιήθηκαν περίπου 200 διαφορικά εκφραζόμενες πρωτεΐνες με διαδοχική φασματομετρία μάζας. Οι περισσότερες από τις πρωτεΐνες αυτές ήταν μοναδικές για κάθε ογκογονίδιο. Υπήρξε όμως και σημαντικός αριθμός πρωτεϊνών ρυθμιζόμενων με κοινό τρόπο από τα δύο ογκογονίδια. Στα Caco2-KRASV12 κύτταρα, διαπιστώθηκε ότι ο μετασχηματισμός από το ογκογονίδιο KRASV12 οδηγεί σε αύξηση των επιπέδων και της ενεργότητας της ενδογενούς HRAS πρωτεΐνης. Η γονιδιακή αποσιώπηση της τελευταίας προκάλεσε αναστροφή των πρωτεομικών αλλαγών που παρατηρήθηκαν στα Caco2-KRASV12 κύτταρα. Η διαπίστωση αυτή ενισχύει την υπόθεση ότι η μεταλλαγμένη και συνεχώς ενεργή KRAS λειτουργεί, τουλάχιστον εν μέρει, μέσω της ενεργοποίησης της 107 ΠΕΡΙΛΗΨΗ ενδογενούς HRAS. Με χρήση χημικών αναστολέων, δείχτηκε επιπλέον ότι το σηματοδοτικό μονοπάτι των MAP κινασών παίζει καθοριστικό ρόλο καθοδικά της ανωτέρω διαδικασίας. Τέλος, δείχτηκε ότι η γονιδιακή αποσιώπηση της HRAS στα Caco2-KRASV12 κύτταρα επαναφέρει την έκφραση κυτταροσκελετικών πρωτεϊνών και συσχετίζεται με τον περιορισμό των μεταστατικών ιδιοτήτων των κυττάρων αυτών. Τα αποτελέσματα αυτά αναδεικνύουν μια πιθανή συνέργια της ογκογόνου ΚRAS και της ενδογενούς HRAS στην καρκινογένεση του παχέος εντέρου