Hsp 70 νανομηχανές και γονιδιακή αποσιώπηση

Abstract

It is known that the proteins Hsp70 and Hsp40 collaborate each other, after they practise many from their operations via creation nanomachines. In the present work manufacturing, with the technology siRNA, HeLa siRNA clones, that did not express the proteins Hsp70 or Hsp40, was checked the increased thermosensitivity and apoptosis that present these clones after heat shock but also under effect of various chemical factors, because of their lack of these proteins. Also, it was revealed that the absence of one protein influences the regulation of the other’s, as reverse. We indeed found that this likely common mechanism of regulation of their expression, seems to happen in the level of transcription or the maturation of RNA. For many years we didn’t know what the target for Hsp70 translocation to the nucleus and nucleolus is. Lately, it has been proposed that Hsp70 translocates to nucleoli, upon a heat shock, together with the denatured substrates in order to renaturate them during recovery at physiological conditions. Here, we propose that Hsp70 translocates to the nucleus and nucleoli in order to participate in pathways concerning the protection of the nucleoplasmic DNA or rDNA from the single strand breaks. The Hsp70 absence in HeLa cells, via Hsp70 gene silencing (knockdown), indicated the essential role of Hsp70 in DNA integrity. Therefore, HeLa Hsp70 depleted cells were very sensitive in heat treatment and their DNA breaks were multiple comparing to that of control HeLa cells. The molecular mechanism via the Hsp70 performs its role at the level of nucleus and nucleolus during the stress was examined. Hsp70 co-localizes with PARP1 in the nucleus/nucleoli as it is observed in confocal studies and binds via its ATPase domain to the BCRT domain of PARP1 as it is revealed with protein-protein interaction assays. Afterwards, we found that Hsp70 also binds simultaneously to XRCC1 and PARP-1 indicating that Hsp70 function takes carry at the level of DNA repair and maybe at the base excision repair system. Making a hypothetical model, we can suggest that Hsp70 is the molecule that binds and deals with PARP1 creating simultaneously the repair proteins, such as XRCC1, at the single strand DNA breaks. Also, we propose that nucleoplasmic DNA and rDNA single strand breaks constitute a new step in that we usually name as nuclear apoptosis and this is the reason for hsp70 nucleoli translocation during apoptotic heat treatment. Our data reveal a previously unrecognized cellular response to heat stress and may reveal novel pathways leading to Hsp70 function in the nucleus/nucleoli and regulation ofnuclear apoptotic signalling.

Είναι γνωστό ότι οι πρωτεΐνες Hsp70 και Hsp40 συνεργάζονται μεταξύ τους, αφού ασκούν πολλές από τις λειτουργίες τους μέσω δημιουργίας νανομηχανών. Στην παρούσα εργασία κατασκευάζοντας, με την τεχνολογία siRNA, κυτταρικές σειρές HeLa που δεν εξέφραζαν τις πρωτεΐνες Hsp70 ή Hsp40, ελέγχθηκε η αυξημένη θερμοευαισθησία και απόπτωση που παρουσιάζουν αυτοί οι κλώνοι μετά από θερμικό σοκ αλλά και κάτω από επίδραση διαφόρων χημικών παραγόντων, λόγω της έλλειψη αυτών των πρωτεϊνών. Επίσης, αποκαλύφθηκε ότι η απουσία της μίας πρωτεΐνης επηρεάζει τη ρύθμιση της άλλης όπως και το αντίστροφο. Βρέθηκε μάλιστα ότι πιθανόν αυτός ο κοινός μηχανισμός ρύθμισης της έκφρασής τους να συμβαίνει στο επίπεδο της μεταγραφής ή της ωρίμανσης του RNA. Για πολλά χρόνια ήταν άγνωστος ο στόχος της μετακίνησης της Hsp70 στον πυρήνα και τον πυρηνίσκο μετά από θερμικό σοκ. Πρόσφατα, έχει προταθεί ότι η Hsp70 μετακινείται στους πυρηνίσκους, κατά τη διάρκεια θερμικού σοκ, μαζί με τα μετουσιωμένα υποστρώματα προκειμένου να τα επαναφέρει στη λειτουργική τους κατάσταση κατά τη διάρκεια της επαναφοράς των κυττάρων σε φυσιολογικές συνθήκες. Στην παρούσα εργασία προτείνουμε ότι η μετακίνηση της Hsp70 στον πυρήνα και τους πυρηνίσκους γίνεται προκειμένου να συμμετέχει σε διάφορα μονοπάτια σχετικά με την προστασία του νουκλεοπλασματικού DNA ή του πυρηνισκικού DNA (rDNA) από τα μονής αλυσίδας σπασίματά τους. Η απουσία της Hsp70 σε κύτταρα HeLa, μέσω γονιδιακής αποσιώπησης (knockdown), έδειξε τον ουσιαστικό ρόλο της Hsp70 στην ακεραιότητα του DNA, αφού κύτταρα HeLa με μηδαμινά επίπεδα Hsp70 ήταν πολύ ευαίσθητα σε θερμική επεξεργασία και οι θραύσεις του DNA τους ήταν πολλαπλάσια σε σύγκριση με αυτά των κανονικών κυττάρων HeLa. Μελετήθηκε ο μοριακός μηχανισμός μέσω του οποίου η Hsp70 εκτελεί το ρόλο της στο επίπεδο πυρήνα και πυρηνίσκου κατά τη διάρκεια θερμικού σοκ. Η Hsp70 συνεντοπίζεται με την PARP1 στον πυρήνα και τους πυρηνίσκους όπως παρατηρείται σε μελέτες ανοσοφθορισμού με συνεστιακό μικροσκόπιο (confocal) και δεσμεύεται μέσω της ATPase περιοχής της, στην περιοχή BCRT της PARP1 όπως αποκαλύπτεται με πειράματα αλληλεπίδρασης μεταξύ πρωτεϊνών (pull down). Κατόπιν, διαπιστώσαμε ότι Hsp70 δεσμεύεται επίσης, ταυτόχρονα και στην XRCC1 (αποκλειστική πρωτεΐνη μηχανισμών επιδιόρθωσης) και στην PARP-1, γεγονός που υποδεικνύει ότι η λειτουργία της Hsp70 πιθανόν να λαμβάνει μέρος στο επίπεδο επιδιόρθωσης του DNA και ίσως στο σύστημα επιδιόρθωσης μέσω αποκοπής βάσεων (BER). Κάνοντας ένα υποθετικό μοντέλο, μπορούμε να προτείνουμε ότι η Hsp70 είναι το μόριο που δεσμεύεται και εμπλέκεται με την PARP1, δημιουργώντας ταυτόχρονα νανομηχανές επιδιόρθωσης που αποτελούνται από πρωτεΐνες, όπως η XRCC1, στις περιοχές των σημειακών θραύσεων του DNA. Επίσης, προτείνουμε ότι οι σημειακές θραύσεις του νουκλεοπλασματικού και πυρηνισκικού DNA (rDNA) αποτελούν ένα νέο βήμα σε αυτό το οποίο ονομάζουμε συνήθως ως πυρηνική απόπτωση και ίσως αυτός να είναι ο λόγος της μετακίνησης της Hsp70 στους πυρήνες και πυρηνίσκους κατά τη διάρκεια αποπτωτικού θερμικού σοκ. Τα αποτελέσματά μας αποκαλύπτουν μία άγνωστη μέχρι σήμερα κυτταρική απόκριση στο θερμικό σοκ και μπορούν να αποκαλύψουν νέα μονοπάτια που οδηγούν στη λειτουργία της Hsp70 στο επίπεδο του πυρήνα και πυρηνίσκου και τη ρύθμιση της πυρηνικής αποπτωτικής σηματοδότησης.