Μοριακή μελέτη τελομερών και τελομεράσης στα μυελοϋπερπλαστικά σύνδρομα

Abstract

Recent published data demonstrate that dynamics of telomere length and telomerase activity is involved in the molecular pathogenesis of many hematological malignancies. Furthermore, the presence of eroded telomeres and enhanced telomerase activity in hematopoietic cells is associated with poor prognosis in these malignancies. Ph1-negative Chronic Myeloproliferative Disorders (Ph- - CMPD) are acquired diseases of the hematopoietic stem cell, which are characterized by clonal proliferation of one or more cell lineages and they are connected with a variable risk of thrombohemorrhagic complications and predisposition to transformation into acute leukemia. The aim of the present study was to evaluate telomere length and telomerase activity in Ph- - CMPD patients either at diagnosis or during the course of the disease and to assess their clinical utility. Sixty-six bone marrow and 60 peripheral blood samples were obtained from 80 Ph- - CMPD patients with median age 62 years (range 17-84 years) and 18 healthy age-matched controls with median age 57 years (range 28-75 years). Thirty-six patients had Polycythemia Vera, 36 had Essential Thombocythemia, 4 had Idiopathic Myelofibrosis and 4 had Unclassified CMPD. Twenty-six samples were studied at diagnosis, whereas 54 during the course of the disease. Telomere length analysis of individual chromosome ends was performed on bone marrow metaphases using Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization (Quantitative- F.I.S.H.). Telomerase activity was determined in bone marrow CD34(+) and CD20(+) cells as well as in peripheral blood CD3(+) T-lymphocytes and granulocytes with TRAP assay. Gene expression of telomerase-associated proteins was assayed by Real-Time Multiplex PCR. Ph- - CMPD patients showed significantly more eroded telomeres (p=0.010) and increased telomerase activity in CD34(+) cells (p=0.005) compared to healthy age-matched individuals. However, there was no statistical difference in telomere length (p=0.451) and enzyme activity (p=0.538) among different groups of Ph- - CMPD. Telomerase activity was not detected in the remaining hematopoietic cells both in patients and healthy controls, which was closely correlated with downregulation in hTERT mRNA expression. Chromosomal aberrations (del2012, del13q14, +8, +9) were found by F.I.S.H. in 37% Ph- - CMPD patients with reduced telomere lengths (p=0.001) and enhanced telomerase activity (p=0.014), especially during the course of the disease (p=0.028). The patients with shortened telomeres displayed a higher incidence of having thrombotic or hemorrhagic events during follow-up (p=0.011), treatment failure (p=0.024) and disease progression to myelofibrosis, myelodysplastic syndromes, secondary leukemia or death (p=0.137). Nevertheless, telomerase expression was not correlated with the above complications. The event free survival (survival without complications, e.g. myelofibrosis, myelodysplastic syndromes, secondary leukemia and death) was significantly shorter in patients with remarkable telomere erosion (Log Rank p=0.033), who demonstrated a 7,71-fold higher probability of having complications within five years from the initial diagnosis (95% CI=2,04-31,49 p<0.001). In conclusion, accelerated telomere shortening due to rapid cell division may not be prevented or restored by telomerase activity in most of the Ph- - CMPD myeloid cells. This loss of telomere stability seems to induce further genetic changes such as chromosomal rearrangement and consequently a multistage neoplastic transformation of these disorders. Moreover, the negative correlation between telomere length and survival probability of Ph- - CMPD patients is indicative that telomere dynamics may serve as a useful prognostic factor for these patients.

Πρόσφατα βιβλιογραφικά δεδομένα δείχνουν ότι η δυναμική του μήκους των τελομερών και της έκφρασης της τελομεράσης συμμετέχουν στη μοριακή παθογένεση πολλών κακοηθών αιματολογικών νοσημάτων. Επιπλέον, η παρουσία σημαντικής βράχυνσης του τελομεριδιακού μήκους και αυξημένης δραστικότητας της τελομεράσης στα αιμοποιητικά κύτταρα συσχετίζεται με χειρότερη πρόγνωση αυτών των νοσημάτων. Τα Ph1-αρνητικά Χρόνια Μυελοϋπερπλαστικά Νοσήματα (Ph- - XMYN) είναι επίκτητες κλωνικές διαταραχές του αρχέγονου αιμοποιητικού κυττάρου, που χαρακτηρίζονται από την αύξηση μιας ή περισσοτέρων σειρών του αιμοποιητικού συστήματος και εκφράζονται με διαφορετικές κλινικές εκδηλώσεις, όπως θρομβώσεις και αιμορραγίες και παρουσιάζουν μία ενδογενή τάση μετάπτωσης σε οξεία λευχαιμία. Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν ο προσδιορισμός του μήκους των τελομερών και της έκφρασης της τελομεράσης σε ασθενείς με Ph- - XMYN τόσο κατά τη διάγνωση όσο και στην πορεία της νόσου και η εκτίμηση της κλινικής τους σημασίας. Μελετήθηκαν 66 δείγματα μυελικών αναρροφημάτων και 60 δείγματα περιφερικού αίματος από 80 ασθενείς με διάμεση ηλικία τα 62 έτη (εύρος 17-84 έτη) και 18 υγιείς μάρτυρες με διάμεση ηλικία τα 57 έτη (εύρος 28-75 έτη). Τριάντα έξι ασθενείς έπασχαν από Αληθή Πολυκυτταραιμία, 36 από Ιδιοπαθή Θρομβοκυτταραιμία, 4 από Ιδιοπαθή Μυελοΐνωση και 4 από Αταξινόμητο Μυελοϋπερπλαστικό νόσημα. Είκοσι έξι δείγματα ελήφθησαν κατά τη διάγνωση, ενώ 54 κατά την πορεία της νόσου. Η ανάλυση των τελομερών πραγματοποιήθηκε σε χρωμοσώματα μεταφάσεων μυελού με Ποσοτική Φθορίζουσα In Situ Υβριδοποίηση (Quantitative-FISH). Η τελομεράση ανιχνεύτηκε σε CD34(+) και CD20(+) κύτταρα μυελού, καθώς και σε CD3(+) Τ-λεμφοκύτταρα και κοκκιοκύτταρα περιφερικού αίματος με την τεχνική TRAP. Η γονιδιακή έκφραση πρωτεϊνών σχετικών με την τελομεράση πραγματοποιήθηκε με Πολλαπλή Αλυσιδωτή Αντίδραση της Πολυμεράσης σε πραγματικό χρόνο (Real-Time Multiplex PCR). Οι ασθενείς με Ph- - ΧΜΥΝ εμφάνισαν σημαντικά βραχύτερα τελομερή (p=0.010) και υψηλότερη έκφραση τελομεράσης στα CD34(+) (p=0.005) από τους υγιείς μάρτυρες. Ωστόσο, μεταξύ των διαφόρων Ph- - ΧΜΥΝ δε βρέθηκε διαφορά στο τελομεριδιακό μήκος (p=0.451) και την ενζυμική ενεργότητα (p=0.538). Η τελομεράση απουσίαζε από τους υπόλοιπους κυτταρικούς πληθυσμούς των ασθενών και των υγιών μαρτύρων, γεγονός που συσχετίστηκε με καταστολή στην έκφραση του hTERT mRNA. Το 37% των ασθενών με χρωμοσωματικές διαταραχές (del2012, del13q14, +8, +9), που ανιχνεύτηκαν με F.I.S.H., χαρακτηρίζονταν από βραχύτερα τελομερή (p=0.001) και υψηλότερη δραστικότητα της τελομεράσης (p=0.014), ιδιαίτερα στην πορεία της νόσου (p=0.028). Οι ασθενείς με βραχέα τελομερή παρουσίασαν μεγαλύτερη συχνότητα εμφάνισης επιπλοκών, όπως θρομβωτικά ή αιμορραγικά επεισόδια μετά τη διάγνωση (p=0.011), κακή απάντηση στη θεραπεία (p=0.024) και εξέλιξη της νόσου προς μυελοΐνωση, μυελοδυσπλαστικό σύνδρομο, οξεία λευχαιμία ή θάνατο (p=0.137). Αντιθέτως, η έκφραση της τελομεράσης δε συσχετίστηκε με τις παραπάνω επιπλοκές. Η επιβίωση ελεύθερη επιπλοκών βρέθηκε σημαντικά μικρότερη στους ασθενείς με βραχέα τελομερή (Log Rank p=0.033), οι οποίοι παρουσίασαν 7,71 φορές μεγαλύτερη πιθανότητα να εμφανίσουν επιπλοκές μέσα στην πενταετία (95% ΔΑ=2,04-31,49 p<0.001). Συμπερασματικά, η μεγάλη μείωση του τελομεριδιακού μήκους στα μυελικά κύτταρα των Ph- - ΧΜΥΝ, εξαιτίας του αυξημένου πολλαπλασιασμού τους, είναι πιθανόν να μην αντισταθμίζεται από τα συγκεκριμένα επίπεδα δραστικότητας της τελομεράσης, γεγονός που φαίνεται να επιφέρει επιπρόσθετες γενετικές βλάβες, όπως χρωμοσωματικές αναδιατάξεις και ενδεχομένως μία πολυσταδιακή νεοπλασματική μεταμόρφωση αυτών των νοσημάτων. Επιπλέον, η αρνητική συσχέτιση της βράχυνσης των τελομερών με την επιβίωση των ασθενών είναι ενδεικτική ότι το τελομεριδιακό μήκος μπορεί να αποτελέσει μοριακό δείκτη με σημαντική προγνωστική αξία για τους ασθενείς με Ph- - ΧΜΥΝ.