Μελέτη της φλεγμονής και της απόπτωσης σε κύτταρα του πνευμονικού παρεγχύματος

Abstract

The aim of this project is to investigate the role of PLA₂ in inflammation and apoptosis in A549 cells, a model for type II pneumonocytes. Within this framework we studied: a) the conditions that induce apoptosis and b) the levels of phospholipase A₂ (PLA₂) isoenzymes after incubation with CH-11, various concentrations of TNF-α, and LPS. We found that CH11 induced significantly the levels of apoptosis. In the other experimental conditions (TNF-α, LPS) percentages of apoptotic cells were similar to the controls (~5%). Incubation of cells with TNF-α resulted in an increase of total PLA₂ levels, of PAF-AcH activity, and in phospho-cPLA₂ levels in the cells compared to the control. Treatment with CH11 led to a significant decrease of total PLA₂ levels and in a phospho-cPLA₂ decrease compared to the control. Finally, incubation of cells with LPS led to a significant increase of sPLA2 IIA levels but not to the total PLA₂ levels. In conclusion, apoptosis in A549 cells induced by CH-11 leads to a decrease of total PLA₂ levels; this might indicate suppression of inflammation. In addition CH11 brought about a significant decrease in P-cPLA₂ levels, which further supports CH11 role as an anti-inflammatory agent. Under our experimental conditions TNF-α did not induce any significant apoptosis and the increase in total PLA₂ might denote induction of inflammation, probably, through activation of NF-κB. Our results suggest that apoptosis and inflammation under our experimental setting are two opposing pathways.

Σκοπός της μελέτης ήταν η διερεύνηση του ρόλου της φωσφολιπάσης Α₂ (PLA₂) στη φλεγμονή και την απόπτωση σε μοντέλο πνευμονοκυττάρων τύπου ΙΙ (Α549). Για το σκοπό αυτό έγινε: - Διερεύνηση των επιπέδων της απόπτωσης μετά από επώαση με TNF-α (20, 50, 100 ng/ml), CH11 (100ng/ml) και LPS (25μg/ml), για 24 και 48 ώρες. - Διερεύνηση των επιπέδων των ισοενζύμων της φωσφολιπάσης Α₂ στα κύτταρα και το υπερκείμενο των κυττάρων μετά από επώαση με ποικίλες συγκεντρώσεις TNF-α (20, 50, 100 ng/ml), CH11 (100ng/ml) και LPS (25μg/ml), για 24 και 48 ώρες. -Διερεύνηση της έκφρασης του CD14 και του Toll-like receptor 4 στα πνευμονοκύτταρα τύπου II μετά από επώαση τους με LPS. - Διερεύνηση του ρόλου των ERK στην φωσφορυλίωση της cPLΑ₂. Συμπεραίνουμε ότι: α) Η επώαση των κυττάρων με TNF-α έχει ως αποτέλεσμα: - Τη στατιστικά σημαντική αύξηση της ενεργότητας της ολικής PLA₂ σε σχέση με το control στις 24h. Πιθανώς Ενεργοποιεί την παραγωγή της PLA₂. - Τη στατιστικά σημαντική αύξηση της ενεργότητας της PAF-AcH στα κύτταρα και το υπερκείμενο. Φαίνεται να ενεργοποιεί την παραγωγή και την έκκριση της PAF-AcH. - Τη στατιστικά σημαντική αύξηση της ενεργότητας της εκκρινόμενης PLA₂ σε σχέση με το control στις 24h. Πιθανώς ενεργοποιεί την έκκριση της PLA₂. - Τη στατιστικά σημαντική αύξηση των επιπέδων της κυτοσολικής PLA₂ σε σχέση με το control στις 24h. Πιθανώς η cPLA₂ ενεργοποιείται από τον TNF-a. - Την αύξηση των επιπέδων της PLA₂ ανεξάρτητης Ca²⁺ σε σχέση με το control στις 24h. Φαίνεται λοιπόν ότι ο TNF-a ενεργοποιεί φλεγμονώδη απόκριση στα κύτταρα Α549 και δεν εμπλέκεται στην πορεία της απόπτωσης. β) Η επώαση των κυττάρων με CH11 έχει ως αποτέλεσμα: - Τη στατιστικά σημαντική αύξηση των επιπέδων της απόπτωσης σε σχέση με το control στις 24 και 48h. - Τη στατιστικά σημαντική μείωση της ενεργότητας της ολικής PLA₂ σε σχέση με το control στις 24h. - Τη στατιστικά σημαντική μείωση της ενεργότητας της εκκρινόμενης PLA₂ σε σχέση με το control στις 24h. - Τη στατιστικά σημαντική αύξηση της ενεργότητας της PAF-AcH στο υπερκείμενο των κυττάρων σε σχέση με το control στις 24h. Πιθανώς ενεργοποιεί την έκκριση της PAF-AcH. - Τη στατιστικά σημαντική μείωση των επιπέδων της κυτοσολικής PLA₂ σε σχέση με το control στις 24h. - Τη μείωση των επιπέδων της PLA₂ ανεξάρτητης Ca²⁺ σε σχέση με το control στις 24h. Φαίνεται ότι το CH11 επάγει την απόπτωση στα κύτταρα Α549 και δεν ενεργοποιεί τη φλεγμονή γ) Η επώαση των κυττάρων με LPS έχει ως αποτέλεσμα: - Τη μικρή αύξηση των επιπέδων της απόπτωσης σε σχέση με το control στις 24 και 48h. - Τη διατήρηση των επιπέδων της ενεργότητας της ολικής PLA₂ στα ίδια επίπεδα με το control στις 24h. - Την στατιστικά σημαντική αύξηση της ενεργότητας της PAF- AcH στο υπερκείμενο των κυττάρων σε σχέση με το control στις 24h. Πιθανώς ενεργοποιεί την έκκριση της PAF-AcH. - Τη διατήρηση των επιπέδων των επιπέδων της κυτοσολικής PLA₂ στα ίδια επίπεδα σε σχέση με το control στις 24h. - Τη στατιστικά σημαντική αύξηση των επιπέδων της εκκρινόμενης PLA₂ ΙΙΑ στα κύτταρα και το υπερκείμενο σε σχέση με το control στις 24h. Φαίνεται να ενεργοποιεί την παραγωγή και την έκκριση της s PLA₂ IIA. Το LPS στις πειραματικές μας συνθήκες δε φαίνεται να επάγει την απόπτωση στα κύτταρα Α549. Ενεργοποιεί φλεγμονώδη απόκριση.