The role of breast cancer resistance protein 1 (BCRP1) in the cardiac side population cells

Abstract

Cardiovascular diseases represent the leading cause of death in the industrialized world. Several scientific advances have achieved significant improvement in disease treatment and patient quality of life. However, with the exception of heart transplantation which represents the most efficient treatment, none of the current therapies focus on replacing the lost cardiac tissue. The identification of mitotic myocytes and more recently, of resident cardiac progenitor cells has abolished the long standing dogma that the heart is a terminally differentiated organ. Cardiac regeneration, through stem cell based therapies has become a promising area of research and has opened new horizons for the treatment of cardiovascular diseases. Cardiac side population (CSP) cells represent a resident cardiac progenitor cell population. CSP cells are identified based on the ability of ABC-cassette membrane transporters to efflux the DNA-binding dye Hoechst 33342. ABC-transporters Abcg2 and Mdr1 have been shown to efficiently export Hoechst. Upon proper stimulation, CSP cells are able to differentiate into all major cardiac cell types. Abcg2 and Mdr1 belong to the large family of ABC-transporters. ABC proteins are involved in the trafficking of a large variety of substrates across the cell membrane and intracellular organelles. Abcg2 and Mdr1 were initially identified in cancer drug resistant cells lines and have been associated with chemotherapy drug resistance observed in cancers. In particular, in addition to cancer resistance, Abcg2 has been suggested to play a protective role in crucial tissues such as the brain and fetus against xenobiotic transfer 9 through the blood-brain and placenta barriers. Abcg2 has also been shown to confer protection from cell death under hypoxic conditions. Most importantly, Abcg2 has been identified as the molecular determinant of the bone marrow SP phenotype. However, its contribution to the cardiac SP phenotype remains unclear. Abcg2 expression has been further linked to the proliferation of cancer cells. Additionally, in bone marrow SP cells, Abcg2 over-expression promoted cell proliferation while its inhibition resulted in abrogation of hematopoiesis. In the heart, Abcg2 expression has been demonstrated to be beneficial following injury by protecting microvascular endothelial cell function. The fundamental characteristic of stem/progenitor cells is the capacity to self-renew and differentiate within one cell division. Stem/progenitor cell homeostasis is achieved through a balance between symmetric and asymmetric cell divisions. Regulation of the switch between these two types of division is of particular importance in normal and cancer stem cells. Deregulated divisions can lead to stem cell pool exhaustion or cancer cell over-proliferation. Cell fate decisions are made during the cell cycle and particularly during the G1- phase. The “cell cycle length” hypothesis suggests that lengthening of G1 is associated and required for stem/progenitor cell asymmetric division and differentiation. The goal of my study is to investigate the role of Abcg2 in the CSP phenotype and homeostasis as well as its effects in vivo, in a myocardial injury context. CSP cells from WT, Abcg2-KO and Mdr1a/b-KO mice from different developmental stages were analyzed by flow cytometry to examine the relative contribution of each 10 transporter. The effects of Abcg2 on CSP cell proliferation and survival were determined through various methods. Gain- and loss-of-function approaches were utilized to confirm the results. Site-mutagenesis allowed the assessment of the role of Abcg2 efflux capacity in CSP proliferation. Cell cycle marker staining, lentiviral cell cycle indicators and RT-PCR based gene arrays were used in combination with live cell imaging, to delineate the cell cycle profile of WT and Abcg2-deficient CSP cells. Immuno-cytochemical staining for cell fate determinants and cardiac markers, revealed the effects of Abcg2 on CSP asymmetric division and cardiomyogenic differentiation. Moreover, ischemia-reperfusion and myocardial infarction were used as myocardial injury models to investigate the in vivo role of Abcg2. Lastly, the surface marker expression, proliferation and differentiation capacity of CSP cells from different developmental stages were analyzed. My work reveals for the first time that Abcg2 has an age-dependent contribution to the CSP phenotype. Moreover, Abcg2 was found to promote CSP cell cycle progression and survival while inhibiting their asymmetric division and differentiation. Finally, my work provides in vivo evidence supporting that Abcg2 plays a protective role following myocardial injury.

Οι καρδιαγγειακές παθήσεις αποτελούν την κύρια αιτία θανάτου στον ανεπτυγμένο κόσμο. Πρόσφατη επιστημονική πρόοδος έχει προσφέρει σημαντική βελτίωση τόσο στις μεθόδους θεραπείας της νόσου όσο και στην ποιότητα ζωής των ασθενών. Ωστόσο, με εξαίρεση τη μεταμόσχευση καρδιάς, η οποία αντιπροσωπεύει την πιο αποτελεσματική θεραπεία, καμία από τις υπάρχουσες θεραπείες δε στοχεύει στην αναγέννηση του κατεστραμμένου καρδιακού ιστού. Η ανακάλυψη μιτωτικών καρδιομυοκυττάρων και πιο πρόσφατα εξωγενών και κυρίως ενδογενών καρδιακών πρόδρομων κυττάρων, έχει πλέον καταρρίψει την αντίληψη ότι η καρδιά αποτελεί ένα όργανο χωρίς αναγεννητική ικανότητα. Η αναγέννηση του καρδιακού ιστού μέσω κυτταρικής θεραπείας αποτελεί έναν πολλά υποσχόμενο ερευνητικό τομέα και έχει ανοίξει νέους ορίζοντες για τη θεραπεία των καρδιαγγειακών παθήσεων. Τα «καρδιακά κύτταρα πλευρικού πληθυσμού» (cardiac side population cells, CSP cells) αποτελούν ενδογενή καρδιακά πρόδρομα κύτταρα. Η αναγνώριση των κυττάρων CSP βασίζεται στην ικανότητα μεμβρανικών μεταφορέων ABC, και ειδικότερα των πρωτεϊνών Abcg2 και Mdr1, να εξάγουν από το κυτταρόπλασμα τη χρωστική ουσία Hoechst 33342. Κάτω από κατάλληλες συνθήκες καλλιέργειας, τα κύτταρα CSP, έχουν την ικανότητα να διαφοροποιούνται σε όλους τους κύριους τύπους καρδιακών κυττάρων. Οι πρωτεΐνες ABC εμπλέκονται στην μεταφορά διαφόρων ουσιών τόσο προς το εξωτερικό του κυττάρου όσο και μεταξύ των κυτταρικών οργανιδίων. Οι πρωτεΐνες Abcg2/Bcrp1 και Mdr1 ανακαλύφθηκαν σε κυτταρικές σειρές που είναι ανθεκτικές στην τοξική δράση αντικαρκινικών ουσιών και έχουν συσχετιστεί με την ανθεκτικότητα σε 5 φάρμακα χημειοθεραπείας που παρατηρείται σε αρκετούς καρκίνους. Επίσης, η πρωτεΐνη Abcg2/Bcrp1 έχει προστατευτικό ρόλο σε ευαίσθητους ιστούς όπως ο εγκέφαλος και το έμβρυο, εναντίον της εισόδου ξενοβιοτικών ουσιών διαμέσου του αιματοεγκεφαλικού φραγμού και του πλακούντα. Έχει επίσης προταθεί ότι ο μεταφορέας Abcg2 παρέχει προστασία από τον κυτταρικό θάνατο σε συνθήκες υποξίας. Η έκφραση του Abcg2 έχει επίσης συσχετισθεί με τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων. Επιπλέον, ο μεταφορέας Abcg2 έχει αναγνωριστεί ως ο καθοριστικός παράγοντας για το φαινότυπο «πλευρικού πληθυσμού» (side population) στο μυελό των οστών (BMSP). Τέλος είναι αξιοσημείωτο ότι σε κύτταρα SP του μυελού των οστών η υπερέκφραση του Abcg2 προώθησε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, ενώ η αναστολή του εμπόδισε τη διαφοροποίηση και την αιμοποιητική διαδικασία. Στην καρδιά έχει αποδειχθεί ότι ύστερα από τραυματισμό ο Abcg2, προστατεύοντας τα ενδοθηλιακά κύτταρα, έχει ευεργετική δράση στη λειτουργία του μυοκαρδίου. Ωστόσο, η συμβολή του στα καρδιακά SP παραμένει ασαφής. Το βασικό χαρακτηριστικό των πρόδρομων κυττάρων είναι η ικανότητα τους να αυτο-ανανεώνονται (self-renewal) και να διαφοροποιούνται (differentiation) προς εξειδικευμένα κύτταρα κατά τη διάρκεια μίας κυτταρικής διαίρεσης. Η ομοιόσταση των πρόδρομων κυττάρων επιτυγχάνεται μέσα από μια ισορροπία μεταξύ συμμετρικών και ασύμμετρων κυτταρικών διαιρέσεων. Η ρύθμιση αυτής της ισορροπίας έχει ιδιαίτερη σημασία τόσο για τα πρόδρομα όσο και για τα καρκινικά κύτταρα. Απορρύθμιση των κυτταρικών διαιρέσεων μπορεί να οδηγήσει σε εξάντληση του αριθμού των πρόδρομων κυττάρων ή αντίστοιχα τον υπερπολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων. Η μοίρα που θα ακολουθήσει το πρόδρομο κύτταρο αποφασίζεται κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου και πιο συγκεκριμένα κατά τη φάση G1. Συμφώνα με την υπόθεση του «μήκους 6 του κυτταρικού κύκλου» (“Cell cycle length” hypothesis) η επιμήκυνση της φάσης G1 συνδέεται με την ασύμμετρη διαίρεση και διαφοροποίηση των βλαστικών/πρόδρομων κυττάρων. Ο στόχος της παρούσας μελέτης είναι η διερεύνηση του ρόλου του μεταφορέα Abcg2 στο φαινότυπο και την ομοιόσταση των κυττάρων CSP, καθώς και στην in vivo επίδρασή του στο πλαίσιο εμφράγματος του μυοκαρδίου. Ποντίκια WT, Abcg2-ΚΟ και Mdr1a/b-KO, από διαφορετικά αναπτυξιακά στάδια, χρησιμοποιήθηκαν ώστε να εξεταστεί η σχετική συνεισφορά του Abcg2 στον καρδιακό φαινότυπο SP. Η επίδραση του Abcg2 στον πολλαπλασιασμό και την επιβίωση των κυττάρων CSP μελετήθηκε μέσω διάφορων μεθόδων. Τα αποτελέσματα επιβεβαιώθηκαν περαιτέρω μέσω τεχνικών κέρδους και απώλειας λειτουργίας (gain/loss of function). Η σημασία της ικανότητας εξαγωγής ουσιών από τον Abcg2 στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων CSP εξετάστηκε μέσω μεταλλαξιγένεσης. Μέθοδοι όπως ανοσο-κυτταροχημική ανίχνευση πρωτεϊνών του κυτταρικού κύκλου, συστήματα αναφοράς δεικτών του κυτταρικού κύκλου με λεντι-ιούς και RT-PCR χρησιμοποιήθηκαν σε συνδυασμό με ζωντανή απεικόνιση κυττάρων, για τον προσδιορισμό του κυτταρικού κύκλου WT και Abcg2-KO κυττάρων CSP. Ο ρόλος του Abcg2 στην ασύμμετρη διαίρεση και την καρδιακή διαφοροποίηση εξετάστηκε μέσω ανοσο-κυτταροχημικής ανίχνευσης πρωτεϊνών που καθορίζουν την κυτταρική μοίρα και καρδιακών δεικτών αντίστοιχα. Επιπλέον, μοντέλα καρδιακής βλάβης, όπως ισχαιμία-επαναιμάτωση και έμφραγμα του μυοκαρδίου χρησιμοποιήθηκαν ώστε να διερευνηθεί ο in vivo ρόλος του Abcg2. Τέλος, αναλύθηκε η έκφραση μεμβρανικών πρωτεϊνών καθώς και η ικανότητα πολλαπλασιασμού και διαφοροποίησης των κυττάρων CSP από διαφορετικά αναπτυξιακά στάδια ποντικού. Η παρούσα διατριβή αποκαλύπτει για πρώτη φορά ότι η συμβολή του μεταφορέα Abcg2 στο φαινότυπο CSP εξαρτάται από το αναπτυξιακό στάδιο. Επιπρόσθετα, ο μεταφορέας Abcg2 βρέθηκε ότι προστατεύει τα κύτταρα CSP από κυτταρικό θάνατο και προάγει τον κυτταρικό τους κύκλο, ενώ παράλληλα αναστέλλει την ασύμμετρη διαίρεση και τη διαφοροποίησή τους. Τέλος, η εργασία μου παρέχει in vivo δεδομένα που υποστηρίζουν ότι ο μεταφορέας Abcg2 έχει σημαντικό προστατευτικό ρόλο μετά από έμφραγμα του μυοκαρδίου.