Μοριακή διερεύνηση του υποδοχέα των οιστρογόνων στα καρδιαγγειακά νοσήματα

Abstract

Atherosclerosis is conidered as one of the most serious diseases of our days. Despite of the fact that all human vessels can develop atherosclerosis, atherosclerotic lesions develop usually at the aorta, the coronary arteries, the carotid arteries and the cerebral arteries. The topography of the lesions is responsible for the increased number of deaths associated with atherosclerosis. It is mainly a degenerative disease of the elastic (aorta, iliac arteries) and medium width muscular arteries, leading ta progressive istological and structural changes and finally to loss of functional properties. Pathogenesis of the disease remains obscure. Many possible theories have been proposed in order to undertand the pathology of the diease and to correlate the possible mechanisms with the well established risk factors (smoking, hypercholesterolaimia etc) Oestrogens, exert their actions through their receptors ERα and ERβ (membrane or nuclear). These receptors have been identified in the endothelial cells and in the vascular smooth muscle cells of the vascular wall. Moreover WBCs and platelets, cells that play a crucial role in the proper endothelial function, contain functional Estrogen Receptors (ERs). One of the aims of this thesis was to identify the presence of Estrogen Receptor α and β in the cardiovascular system. For this reason we examined: · Vessels with atherosclerotic lesions: samples of aorta from patients undergoing by-pass surgery (15 samples) · Normal vessels: internal mammary artery, greater saphenous vein from the same patients (17 normal samples) The experimental methods used included omogenisation and lysis of the examined tissues, isolation of total mRNA, reverse transcription (RT), polymerase chain reaction (PCR) and agarose gel electrophoresis. The presence of ER was identified in the both atherosclerotic and normal vessel walls. For the same reasons, we examined patients with coronary heart disease, diagnosed by angiography. The purpose of this study was the molecular analysis of estrogen receptor α (ERα) in order to identify point mutations, insertions and deletions and their possible correlation with the development of atherosclerosis. We examined: · 40 male patients with coronary heart disease · 50 normal subjects The experimental methods included isolation of genomic DNA from blood samples, polymerase chain reaction (PCR) with specific primers, agarose gel electrophoresis, mutation analysis by means of DGGE(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis), SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism) and Sequencing. We identified: a) the presence of homozygous wild type codon 10 (TCT/TCT), the homozygous mutant type codon 10 (TCC/TCC) and the heterozygous type (TCT/TCC), b) the presence of homozygous wild type 87 (GCG/GCG) polymorhisms. No other mutations were detected. Statistical analysis of genotype and allele distribution revealed no statistical difference. Another aim of this thesis was the molecular analysis of estrogen receptor ERa in hypertensive patients. Hypertension constitutes the main cause of coronary heart disease It is considered as the main cause of atherosclerosis and ischaimic cerebral disease. The clinical appearance of hypertension is the result of the long- term deficiency of the fuctional mechanisms controlinh homeostasis and blood pressure. As it is well known, arterial pressure is constantly under the control of local, chemical and hormonal factors. Oestrogens , through their receptors can modulate arterial function and therefore blood pressure. Moreover, they exert their influence on the rennin-vasopressin system. In order to avoid any hormonal deficiencies our population consisted of premenopausal women. We examined: · 20 promenaupausal hypertensive women · 20 promenaupausal normotensive women The experimental methods included isolation of genomic DNA from blood samples, polymerase chain reaction (PCR) with specific primers, agarose gel electrophoresis, mutation analysis by means of DGGE(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis), SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism) and Sequencing. We identified: a) the presence of homozygous wild type codon 10 (TCT/TCT), the homozygous mutant type codon 10 (TCC/TCC) and the heterozygous type (TCT/TCC), b) the presence of homozygous wild type 87 (GCG/GCG) polymorhisms. No other mutations were detected. Statistical analysis of genotype and allele distribution revealed no statistical difference.

Η αθηροσκλήρυνση αποτελεί ένα από τα σημαντικότερα νοσήματα του σύγχρονου τρόπου ζωής. Παρά το γεγονός ότι όλα τα αγγεία μπορούν να εμφανίσουν αθηρωματικές βλάβες, οι συχνότερες εντοπίσεις της νόσου αφορούν την αορτή, τα στεφανιαία και τις εγκεφαλικές αρτηρίες. Γι’ αυτό το λόγο και το έμφραγμα του μυοκαρδίου και τα αγγειακά εγκεφαλικά επεισόδια αποτελούν τις κύριες αιτίες θανάτου των ασθενών αυτών. Ουσιαστικά πρόκειται περί μιας εκφυλιστικής νόσου που προσβάλει τις ελαστικού τύπου (αορτή, λαγόνιες αρτηρίες) και τις ενδιαμέσου εύρους μυϊκού τύπου αρτηρίες οδηγώντας προοδευτικά στην καταστροφή της ιστολογικής τους αρχιτεκτονικής και στο περιορισμό του εύρους του αυλού. Η παθογένεια της νόσου δεν είναι απόλυτα διευκρινισμένη. Πολλές θεωρίες έχουν κατά καιρούς διατυπωθεί στην προσπάθεια να συνδυαστούν οι γνωστοί πλέον παράγοντες κινδύνου με τα ιστολογικά και κλινικά ευρήματα της νόσου. Τα οιστρογόνα είναι γνωστό ότι ασκούν τη δράση τους μέσω των υποδοχέων τους ERa και ERβ. Οι υποδοχείς αυτοί, στο καρδιαγγειακό σύστημα, έχουν εντοπισθεί τόσο στο ενδοθήλιο όσο και στη στοιβάδα των λείων μυικών ινών του αγγειακόυ τοιχώματος. Επιπλέον, όπως είναι γνωστό, οι υποδοχείς των οιστρογόνων εκφράζονται τόσο στα κύτταρα που ευθύνονται για τη χημειοταξία, όσο και στα αιμοπετάλια. Ένας εκ των σκοπών της διατριβής αποτελούσε την αναγνώριση και ταυτοποίηση των υποδοχέων των οιστρογόνων ERα και ERβ στους ιστούς του καρδιαγγειακού συστήματος. Μελετήθηκαν: · Παθολογικά δείγματα ιστού: αγγεία (ρίζα αορτής) ασθενών που υποβλήθηκαν σε αορτοστεφανιαία παράκμψη (by-pass) (15 ασθενείς) · ως φυσιολογικά αγγεία ελέχθησαν: η έσω μαστική αρτηρία ή η μείζων σαφηνής φλέβα από τους ιδίους ασθενείς (17 φυσιολογικά αγγεία) Οι τεχνικές που χρησιμοποιήθηκαν συμπεριελάμβαναν ομογενοποήση και λύση του ιστού, απομόνωση ολικού mRNA, αντίστροφη μεταγραφή (RT), αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) και ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης. Η παραπάνω μελέτη επιβεβαίωσε την παρουσία τόσο του ERα όσο και του ERβ στα αγγεία που μελετήθηκαν. Παράλληλα και για τους ίδιους λόγους, μελετήθηκαν ασθενείς με στεφαναία νόσο, επιβεβαιωμένη με αγγειογραφία. Σκοπός της μελέτης ήταν η μοριακή μελέτη του υποδοχέα των οιστρογόνων ERα προκειμένου να διαπιστωθεί η παρουσία σημειακών μεταλλάξεων, προσθηκών ή ελλείψεων στο αμινοτελικό άκρο του υποδοχέα και η πιθανή συσχέτιση τους με τη νόσο και την κλινική εικόνα. Μλετήθηκαν: · 40 άρρενες ασθενείς με στεφανιαία νόσο, επιβεβαιωμένη με αγγειογραφία · 50 φυσιολογικοί μάρτυρες Οι τεχνικές που χρησιμοποιήθηκαν συμπεριελάμβαναν την απομόνωση γενωμικού DNA από δείγματα αίματος ασθενών, την ενίσχυση των περιοχών μελέτης με ειδικούς εκκινητές με την αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR), την ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης και την ανίχνευση σημειακών μεταλλάξεων με τεχνικές όπως η DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis: ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα βαθμίδωσης πυκνότητας αποδιατακτικών παραγόντων), η SSCP( Single Strand Conformation Polymorphism: τεχνική ανάλυσης στερεοδιαμόρφωσης απλής αλυσίδας) και το Sequencing( προσδιορισμός πρωτοδιάταξης του DNA). Από την μελέτη ανιχνεύθηκαν οι πολυμορφισμοί των κωδικονίων 10 και 87, σε ετερόζυγη (TCT/TCC) και ομόζυγη μορφή (TCC/TCC) όσον αφορά στον πρώτο και σε ετερόζυγη μόνο μορφή (GCG/GCG) όσον αφορά το δεύτερο πολυμορφισμό. Σύγκριση της κατανομής των γονοτύπων μεταξύ ασθενών και φυσιολογικού πληθυσμού δεν κατέδειξε στατιστικά σημαντική διαφορά, ενώ στατιστικά σημαντικά στοιχεία προέκειψαν μεταξύ πολυμορφισμών και βιοχημικών παραγόντων. Ένας άλλος σκοπός της παρούσης διατριβής ήταν η μοριακή μελέτη του υποδοχέα των οιστρογόνων ΕRα σε ασθενείς με αρτηριακή υπέρταση. Η τελευταία αποτελεί τον σημαντικότερο αιτιολογικό παράγοντα της στεφανιαίας νόσου και των αγγειακών εγκεφαλικών επεισοδίων. Η κλινική εμφάνιση της υπέρτασης είναι αποτέλεσμα της χρόνιας ανεπάρκειας των αντιρροπιστικών μηχανισμών του κυκλοφορικού συστήματος στον έλεγχο της Α.Π. Υπό φυσιολογικές συνθήκες, η Α.Π. βρίσκεται υπό τον άμεσο έλεγχο καρδιακών, χυμικών, νευρογενών και τοπικών παραγόντων. Τα οιστρογόνα, μέσω των υποδοχέων τους, παίζουν ρυθμιστικό ρόλο στον έλεγχο της αρτηριακής πίεσης. Για την ασφάλεστερη δυνατή συσχέτηση με την μελέτη του υποδοχέα επιλέχθησαν γυναίκες με αρτηριακή υπέρταση προ της ηλικίας της εμμηνόπαυσης. Συγκεκριμένα μελετήθηκαν: · 20 προεμμηνοπαυσιακές υπερτασικές ασθενείς · 20 προεμμηνοπαυσιακές γυναίκες με φυσιολογική αρτηριακή πίεση Οι τεχνικές που χρησιμοποιήθηκαν συμπεριελάμβαναν την απομόνωση γενωμικού DNA από δείγματα αίματος ασθενών, την ενίσχυση των περιοχών μελέτης με ειδικούς εκκινητές με την αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR), την ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης και την ανίχνευση σημειακών μεταλλάξεων με τεχνικές όπως η DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis: ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα βαθμίδωσης πυκνότητας αποδιατακτικών παραγόντων), η SSCP( Single Strand Conformation Polymorphism: τεχνική ανάλυσης στερεοδιαμόρφωσης απλής αλυσίδας) και το Sequencing( προσδιορισμός πρωτοδιάταξης του DNA). Από την μελέτη ανιχνεύθηκαν οι πολυμορφισμοί των κωδικονίων 10 και 87, σε ετερόζυγη (TCT/TCC) και ομόζυγη μορφή (TCC/TCC) όσον αφορά στον πρώτο και σε ετερόζυγη μόνο μορφή (GCG/GCG) όσον αφορά το δεύτερο πολυμορφισμό. Σύγκριση της κατανομής των γονοτύπων μεταξύ ασθενών και φυσιολογικού πληθυσμού δεν κατέδειξε στατιστικά σημαντική διαφορά.