Θερμοδυναμικές μελέτες αμιδίων και πεπτιδίων ως μοντέλων βιολογικών μορίων με τη συνδυαστική χρήση πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού και δονητικής φασματοσκοπίας

Abstract

The cis-trans isomerization of the peptide group is very significant in many processes that require alteration of peptide and protein structure, such as stability, folding, denaturation and recognition of peptides and proteins. In the present work, the cis-trans equilibrium of very simple model peptides was investigated by the use of variable temperature ¹Η-NMR, FT-IR and thermodynamic calculations in aqueous solutions and in various organic solvents with varying dielectric constant and solvation ability. Variable temperature ¹Η-NMR studies of the cis-trans conformational equilibrium of N-substituted amides in aqueous and apolar solutions demonstrate that ΔΗ° and ΔS° values indicate significant variations. In planar amides at 298K and in the absence of bulky N-substitution, like N-methylformamide (NMF), the thermodynamic difference of the cis-trans isomers is due to enthalpic differences in both polar and apolar media with a significant contribution of entropy. In sterically hindered amides, like N-tert-butylformamide (TBF), the contribution of entropy at 298K becomes, generally, equal to the effect of enthalpy in both polar and apolar solutions. A decreasing enthalpic benefit of the trans isomer, in all the examined cases, is partially offset by an adverse entropy contribution, in agreement with the general phenomenon of enthalpy versus entropy compensation. This study provides direct evidence that both enthalpy and entropy are strongly dependent on the N-alkyl substitution of the amide bond and the nature of the solvent. Extensive studies upon temperature and concentration dependence of the amide proton chemical shift and of the infrared absorption band of free and hydrogen bonded NH group show that in polar media intermolecular interactions between amide and solvent molecules are dominant. On the contrary, in less polar solvents and as the concentration of the amide increases, self-association between amide molecules becomes significant by forming very stable cyclic dimers between cis isomers via strong hydrogen bonds and/or polymeric amide chains. Finally, N-substitution of N-alkylformamides has been found to play very important role to the cis-trans equilibrium of the peptide bond. Generally, increasing the volume of the N-substitution results to an increase of the percentage of the cis isomer of the amide. The crystal structure of N-acetyl-L-proline was determined via X-ray crystallography. Each N-acetyl-L-proline molecule cocrystallizes with a water molecule and adopts the trans conformation without forming intramolecular hydrogen bond γ-turn). In the crystal, N-acetyl-L-proline forms channels that enclose the water molecules. Each water molecule forms three hydrogen bonds to individual N-acetyl-L- proline molecules in the channel, being an important part in the crystal packing and, thus, strengthening the lattice. The cis-trans equilibrium of N-acetyl-L-proline and its derivatives like N-methylamide and methylester in solution was, also, investigated by FT-IR and ¹Η-NMR spectroscopy, showing the preference for the trans isomer and the formation of γ-turn in less polar solvents.

Σκοπός της εργασίας είναι η σε βάθος μελέτη του cis-trans ισομερισμού πρότυπων ενώσεων αμιδίων και η δυνατότητα εξαγωγής συμπερασμάτων που αφορούν πεπτίδια και πρωτεΐνες. Συγκεκριμένα, τα μοντέλα πεπτιδίων N-μεθυλοφορμαμίδιο (NMF), N-tert-βουτυλοφορμαμίδιο (TBF), N-ακετυλο-L-προλίνη καθώς και το N-μεθυλαμίδιο και ο μεθυλεστέρας αυτής μελετήθηκαν με τη χρήση πρωτονιακής φασματοσκοπίας πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού (NMR-¹H), όπως επίσης και υπέρυθρης φασματοσκοπίας με μετασχηματισμό Fourier (FT-IR), προκειμένου να διερευνηθούν οι διαμοριακές αλληλεπιδράσεις αμιδίου-αμιδίου και αμιδίου-διαλύτη σε διαφορετικούς διαλύτες. Χρησιμοποιήθηκαν επιλεγμένοι διαλύτες διαφορετικής διηλεκτρικής σταθεράς και ικανότητας επιδιαλύτωσης, προσομοιάζοντας περιβάλλοντα είτε υδρόφιλων είτε υδρόφοβων ιδιοτήτων, όπως είναι οι περιοχές λιπιδίων των μεμβρανών. Καλύφθηκε ένα ευρύ φάσμα συγκεντρώσεων, από την περίπτωση εξαιρετικά αραιών έως πολύ πυκνών διαλυμάτων. Μετρήσεις των χημικών μετατοπίσεων ΝΗ, ως συνάρτηση της συγκέντρωσης είναι δυνατόν να δώσουν πολύτιμες πληροφορίες σχετικά με τη δυνατότητα σχηματισμού διαμοριακών και ενδομοριακών δεσμών υδρογόνου σε βιολογικά μόρια. Παράλληλα, πραγματοποιήθηκαν μελέτες μεταβλητής θερμοκρασίας σε ένα εύρος θερμοκρασιών υπαγορευόμενο από τον εκάστοτε διαλύτη με σκοπό τη θερμοδυναμική μελέτη του φαινομένου. Στόχος της παρούσης ερευνητικής εργασίας είναι η προσπάθεια, μέσω ερμηνείας της τρισδιάστατης δομής απλών μορίων-μοντέλων, να αποσαφηνισθούν τα αίτια που αφενός ωθούν μία πρωτεϊνική αλυσίδα σε συγκεκριμένο τρόπο αναδίπλωσης και αφετέρου τη σταθεροποιούν μέσω δημιουργίας χαρακτηριστικών δεσμών υδρογόνου. Επίσης, διερευνάται η εξάρτηση των σχηματιζόμενων δεσμών υδρογόνου από το υδρόφιλο ή υδρόφοβο περιβάλλον. Στα πλαίσια μελέτης του cis-trans ισομερισμού αποδεικνύεται πως η παρουσία Ν-αλκυλο-υποκαταστάτη, όπως για παράδειγμα στα N-αλκυλοφορμαμίδια, και παράπλευρης αλυσίδας, όπως στην περίπτωση της N-ακετυλο-L-προλίνης και των παραγώγων ενώσεων αυτής, καθώς επίσης και ο τρόπος επιδιαλύτωσης του αμιδικού δεσμού είναι παράγοντες που επηρεάζουν τη διαφορετική σταθερότητα των cis και trans ισομερών μορφών. Οι σταθερές προάσπισης της πρωτονιακής NMR φασματοσκοπίας είναι ιδιαίτερα ευαίσθητες σε ατομικές και μοριακές ηλεκτρονικές επιδράσεις και, ως εκ τούτου, δύνανται να χρησιμοποιηθούν για τη μελέτη επιδράσεων του διαλύτη επί της cis-trans αλληλομετατροπής αμιδικών και πεπτιδικών δεσμών. Ωστόσο, σε πολλές περιπτώσεις οι διαμοριακές επιδράσεις στις πρωτονιακές χημικές μετατοπίσεις είναι της ίδιας τάξης μεγέθους με τις ενδομοριακές και αυτό περιπλέκει την ποσοτική εκτίμηση ειδικών φαινομένων που άπτονται της φύσης του διαλύτη (Gerothanassis et al., 1994). Οι συγκεντρώσεις των μοντέλων πεπτιδίων επιλέχτηκαν έτσι ώστε να ελαχιστοποιούνται κατά το δυνατόν οι διαμοριακές αλληλεπιδράσεις αμιδίου-αμιδίου (αποφυγή φαινομένων διμερισμού ή/και πολυμερισμού) και να παρατηρείται αποκλειστικά το φαινόμενο του cis-trans ισομερισμού. Πρόκειται για μελέτη όπου από το λόγο των ολοκληρωμάτων των κορυφών, που αντιστοιχούν στο cis και trans ισομερές, δύναται να εξαχθεί η σταθερά ισορροπίας (Keq) μεταξύ των δύο ισομερών. Στη συνέχεια γίνεται προσδιορισμός της σταθεράς ισορροπίας για ένα εύρος θερμοκρασιών, προκειμένου να εξαχθούν ανά περίπτωση οι θερμοδυναμικές παράμετροι ενθαλπίας και εντροπίας. Έτσι, θα υπάρξει δυνατότητα να δοθεί ερμηνεία στον ρόλο του κάθε διαλύτη, στον τρόπο αλληλεπίδρασης αμιδίου-διαλύτη και κατ’ επέκταση να αποσαφηνισθεί, ενδεχομένως, το γιατί, σε ποιο βαθμό και υπό ποιες συνθήκες (υδρόφοβο/υδρόφιλο περιβάλλον) ευνοείται η cis ή η trans διαμόρφωση του πεπτιδικού δεσμού.