Υπερμικροσκοπική και ανοσοϊστοχημική μελέτη χειρουργικά εξαιρεθέντων ιστών σε περιπτώσεις παραγωγικής υαλοειδοαμφιβληστροειδοπάθειας

Abstract

The present study compares clinical parameters of proliferative vitreoretinopathy (PVR) patients to morphological appearance and immunohistochemical characteristics of surgically excised tissue of the above patients; it also aims to investigate correlation between PVR and certain clinical variables of retinal detachment patients. We included epiretinal membrane specimens and vitreous samples obtained from 28 PVR patients, vitreous samples obtained from 6 pseudophakic retinal detachment patients, without any clinical sign of PVR, vitreous samples obtained from 2 macular hole patients and epiretinal membrane specimens excised from 4 idiopathic epiretinal membrane patients. Patients who were subjected to vitrectomy and/or epiretinal membrane surgical excision, for reasons other than retinal detachment due to PVR formation, served as controls. Optic microscopy and transmission electron microscopy examination as well as immunohistochemical study of our epiretinal membrane and vitreous samples was conducted. We used three mouse monoclonal antibodies, anti-CK19, anti-GFAP and anti-a-SMA for immunohistochemical examination. Chi square testing was used for statistical evaluation of our results. Retinal pigment epithelial cells, glial cells, macrophages, hyalocytes, fibroblasts, myofibroblasts and lymphocytes were found in epiretinal membranes. Cellular elements indicative of the presence of epithelial cells, fibroblasts and hyalocytes-macrophages were observed in vitreous samples. All seven PVR epiretinal membranes were a-SMA positive, one of them was found anti-CK19 positive whereas three were anti-GFAP positive. Five out of eight PVR vitreous samples were anti-a-SMA and anti-CK19 positive whereas two of them were anti-GFAP positive. Fibroblasts, macrophages, epithelioid cells and possible melanin granule deposits were observed in vitreous samples obtained from pseudophakic retinal detachment patients. One out of three of these samples was anti- a-SMA positive, one was anti-CK19 positive and one was found to be anti-GFAP positive. Fibroblasts was the only cellular type seen in idiopathic epiretinal membrane specimens; three of them were anti-a-SMA positive, one was anti-CK19 positive and all of them were anti-GFAP negative. A few fibroblasts were also seen in vitreous samples obtained from macular hole patients but none of them was positive to any of the three antibodies used. With respect to the results, presence of T-lymphocytes in PVR epiretinal membranes is especially related to previous silicone-oil tamponade (p<0,05); fibroblasts are rarely seen in post-traumatic PVR epiretinal membranes (p<0,05). History of retinal detachment surgery coexists with PVR development (p<0,01), regardless of surgical technique used, extraocular surgery or vitrectomy. Phakic patients seem to develop PVR more often than the pseudophakic ones (p<0,001). There is an increased expression of anti-GFAP in PVR epiretinal membranes of patients with a history of previous silicone-oil endotamponade (p<0.05). There is also a statistically significant negative correlation between former retinal detachment surgery and anti-CK19 positiveness of PVR epiretinal membranes obtained from patients with such a history (p>0,05). Conclusively, the origin of PVR epiretinal membrane cells seems to be glial cells whereas origin of PVR vitreous cells seems to be RPE cells. There is migration of RPE as well as of glial cells into the vitreous cavity of uncomplicated by PVR pseudophakic retinal detachment patients but this doesnot seem to be enough for the activation of the pathogenetical procedure which may lead to PVR formation. The absence of lymphocytes in the vitreous cavity of pseudophakic retinal detachment patients who are presented without any clinical sign of serious PVR probably shows direct involvement of the immune system in PVR development. Anti-a-SMA positiveness of vitreous samples obtained from pseudophakic retinal detachment patients could be an objective risk factor for PVR formation. The more complicated surgical techniques used to reattach the retina the higher seems to be the risk for advanced PVR to develop. The role of RPE cells in postoperative PVR formation is probably overestimated in terms of which kind of cells has been so far mainly implicated in the development of PVR.

Η παρούσα μελέτη αποσκοπεί στη διερεύνηση του συσχετισμού μεταξύ των κλινικών χαρακτηριστικών ασθενών με αποκόλληση αμφιβληστροειδούς λόγω ανάπτυξης παραγωγικής υαλοειδοαμφιβληστροειδοπάθειας και της μορφολογίας καθώς και των ανοσοϊστοχημικών χαρακτηριστικών χειρουργικά εξαιρεθέντων ιστών των ασθενών αυτών. Διερευνάται επίσης η πιθανή σχέση μεταξύ της ανάπτυξης ΠΥΑ και ορισμένων από τα κλινικά γνωρίσματα των παραπάνω ασθενών. Το υλικό της μελέτης αποτελούν δείγματα υαλοειδούς και επαμφιβληστροειδικές μεμβράνες, που εξαιρέθηκαν χειρουργικά από 28 ασθενείς με ΠΥΑ, δείγματα υαλοειδούς, που επίσης αποκτήθηκαν μετά από χειρουργική επέμβαση σε 6 ασθενείς με ψευδόφακη αποκόλληση αμφιβληστροειδούς και σε 2 ασθενείς με οπή ωχράς καθώς και 4 δείγματα ιδιοπαθών επαμφιβληστροειδικών μεμβρανών. Οι χειρουργικά εξαιρεθέντες ιστοί ασθενών, που υποβλήθηκαν σε υαλοειδεκτομή ή σε αφαίρεση επαμφιβληστροειδικών μεμβρανών για λόγους διαφορετικούς της ΠΥΑ, χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες προς σύγκριση των ευρημάτων. Στα πλαίσια της σύγκρισης των ευρημάτων ασθενών με ΠΥΑ σε σχέση με αυτά ασθενών βιτρεκτομηθέντων για άλλα αίτια, στη μελέτη συμπεριλάβαμε έξι ψευδόφακους ασθενείς με ρηγματογενή αποκόλληση, που υποβλήθηκαν σε υαλοειδεκτομή, χωρίς να υπάρχουν κλινικά σημεία ΠΥΑ σε κανένα από τα περιστατικά αυτά. Η λήψη των δειγμάτων υαλοειδούς έγινε κατά τη διάρκεια υαλοειδεκτομής, από το κέντρο της υαλοειδικής κοιλότητας και μετά το άνοιγμα της ενδοϋαλοειδικής έγχυσης. Τα προς ανίχνευση επί των τομών κύρια αντισώματα, που χρησιμοποιήθηκαν, ήταν τα μονοκλωνικά αντισώματα επίμυος (mouse monoclonal) για τις πρωτεΐνες: CK19 (cytokeratin 19), GFAP (glial fibrillary acicid protein) και a-SMA (alpha smooth muscle actin) σε αραιώσεις 1:100 για τα δύο πρώτα και 1:50 για το τελευταίο αντίσωμα. Το κιτ ανοσοϊστοχημείας που χρησιμοποιήθηκε διέθετε τα εξής προς χρήση έτοιμα αντιδραστήρια: ίππειο ορό (blocking serum), το δευτερογενές βιοτινυλιωμένο αντίσωμα (biotinylated secondary antibody) και το αντιδραστήριο στρεπταβιδίνης (streptavidin/peroxidase complex). Η δοκιμασία χ² χρησιμοποιήθηκε στη στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα της μελέτης των δειγμάτων στο ηλεκτρονικό μικροσκόπιο, επιθηλιακά κύτταρα του μελαγχρόου επιθηλίου του αμφιβληστροειδούς, κύτταρα γλοίας, μακροφάγα, υαλοκύτταρα, ινοβλάστες, μυοϊνοβλάστες και λεμφοκύτταρα βρέθηκαν στις επαμφιβληστροειδικές μεμβράνες, που προήλθαν από ασθενείς με παραγωγική υαλοειδοαμφιβληστροειδοπάθεια. Κυτταρικά στοιχεία, ενδεικτικά της παρουσίας επιθηλιακών κυττάρων, ινοβλαστών και υαλοκυττάρων-μακροφάγων βρέθηκαν στις τομές των υαλοειδικών δειγμάτων που εξετάστηκαν. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα της μελέτης στο οπτικό μικροσκόπιο και μετά από χρώση με αιματοξυλίνη-εωσίνη τομών μεμβρανών, που προήλθαν από ασθενείς με ΠΥΑ, τα κύτταρα που διακρίναμε ήταν αυτά με μορφολογικά χαρακτηριστικά ινοβλαστών ή μυοϊνοβλαστών, μακροφάγων και επιθηλιακών ή επιθηλιοειδών κυττάρων ενώ σε κάποιες τομές βρέθηκαν επιπλέον εξωκυτταρικά κοκκία μελανίνης, λεμφοκύτταρα και πλασμοκύτταρα. Εντός των τριών ειδών κυττάρων που διακρίθηκαν, βρέθηκαν σε ορισμένες τομές ενδοκυτταρικά κοκκία μελανίνης. Η ανοσοϊστοχημική μελέτη κατέδειξε τη θετικότητα όλων των εν λόγω τομών για την πρωτεΐνη a-SMA, ενώ μόνο μία από τις μεμβράνες αυτές εμφανίστηκε θετική για την πρωτεΐνη CK19 και τρείς για τη GFAP, σε σύνολο επτά επαμφιβληστροειδικών μεμβρανών προερχόμενων από ασθενείς με ΠΥΑ. Μετά από χρώση με αιματοξυλίνη-εωσίνη τομών δειγμάτων υαλοειδούς που προήλθαν από ασθενείς με ΠΥΑ, διακρίναμε κύτταρα με μορφολογικά χαρακτηριστικά ινοβλαστών, μακροφάγων και επιθηλιοειδών κυττάρων, με ενδοκυτταρικά κοκκία μελανίνης σε ορισμένα από αυτά, καθώς και λεμφοκύτταρα, πλασμοκύτταρα και ερυθρά αιμοσφαίρια ενώ σε κάποιες τομές υπήρξαν και εξωκυτταρικά κοκκία μελανίνης. Η ανοσοϊστοχημική μελέτη έδωσε πέντε από τα οκτώ δείγματα θετικά για την a-SMA και επίσης πέντε δείγματα θετικά για την CK19 ενώ δύο από τα οκτώ εμφανίστηκαν θετικά για την GFAP. Στις τομές υαλοειδούς ασθενών με ψευδόφακη αποκόλληση, παρατηρήθηκαν ινοβλάστες, μακροφάγα, επιθηλιοειδή κύτταρα και εξωκυττάριες εναποθέσεις μελανίνης. Σύμφωνα με την ανοσοϊστοχημική μελέτη, σε σύνολο τριών δειγμάτων υαλοειδούς ασθενών με ψευδόφακη αποκόλληση, για τα οποία η μελέτη ήταν δυνατή, ένα ήταν θετικό για την a-SMA, ένα για την CK19 και ένα για την GFAP. Συμπερασματικά, υπήρξε στατιστικά σημαντική θετική σχέση μεταξύ Τ-λεμφοκυττάρων και ιστορικού επιπωματισμού της υαλοειδικής κοιλότητας με έλαιο σιλικόνης ενώ στατιστικά σημαντική προέκυψε η αρνητική σχέση μεταξύ της παρουσίας ινοβλαστών στις επαμφιβληστροειδικές μεμβράνες ασθενών με ΠΥΑ και ιστορικού τραύματος. Στατιστικά σημαντική σχέση ήταν επίσης αυτή μεταξύ ανεπιτυχούς προηγούμενης εγχείρησης αποκόλλησης αμφιβληστροειδούς και εμφάνισης ΠΥΑ ενώ στατιστικά σημαντικός βρέθηκε και ο αρνητικός συσχετισμός ψευδοφακικής αποκόλλησης και ανάπτυξης ΠΥΑ. Συνοψίζοντας τα ανοσοϊστοχημικά μας ευρήματα, καταλήγουμε στο συμπέρασμα, ότι η προέλευση των κυττάρων των επαμφιβληστροειδικών μεμβρανών ασθενών με ΠΥΑ φαίνεται να είναι κυρίως κύτταρα γλοίας, ενώ η αντίστοιχη των κυττάρων του υαλοειδούς φαίνεται να είναι κυρίως επιθηλιακά κύτταρα του μελαγχρόου επιθηλίου του αμφιβληστροειδούς. Η ταυτόχρονα θετική χρώση στις μεμβράνες για την anti-GFAP και την anti-a-SMA και η θετική χρώση στο υαλοειδές για την anti-CK19, ενισχύει συμπεράσματα προηγούμενων μελετών, κατά τις οποίες, καλλιεργηθέντα κύτταρα γλοίας πειραματοζώων αποκτούν ικανότητα σύσπασης του εξωκυτταρικού στρώματος και προϊόντα έκκρισης των επιθηλιακών κυττάρων του μελαγχρόου επιθηλίου κατά τη διαδικασία αποδιαφοροποίησης των κυττάρων αυτών, υποκινούν τη σύσπαση του εξωκυτταρικού στρώματος των μεμβρανών από τα επίσης αποδιαφοροποιημένα κύτταρα του Müller. Η παρουσία μακροφάγων τόσο στο υαλοειδές ασθενών, που χειρουργήθηκαν, λόγω ψευδόφακης αποκόλλησης όσο και εκείνων με αποκόλληση και πρώϊμη ή προχωρημένη ΠΥΑ, καταδεικνύει τη σημασία της φλεγμονώδους απάντησης τόσο στα αρχικά όσο και στα μεταγενέστερα στάδια της ΠΥΑ, δείχνει όμως ταυτόχρονα, ότι απαιτούνται και άλλοι παράγοντες, κυτταρικοί τύποι ή μηχανισμοί προκειμένου να διαμορφωθούν οι συνθήκες για την ανάπτυξή της. Τα κύτταρα, που χαρακτηρίστηκαν ως επιθηλιοειδή απαντώνται επίσης στα περισσότερα από τα δείγματα υαλοειδούς και των δύο παραπάνω ομάδων ασθενών, γεγονός, που ενισχύει τις ενδείξεις, που ήδη υπήρχαν από τη μελέτη στο ηλεκτρονικό μικροσκόπιο, σχετικά με την ύπαρξη στοιχείων επιθηλιακής παρουσίας στο υαλοειδές ασθενών με ψευδόφακη αποκόλληση, χωρίς κλινικά εμφανή στοιχεία ΠΥΑ. Ανεξάρτητα από την προέλευση των κυττάρων αυτών, είτε από το μελάγχρουν επιθήλιο είτε από το ακτινωτό σώμα ή την ίριδα, φαίνεται ότι, η παρουσία επιθηλιακών κυττάρων στην υαλοειδική κοιλότητα δεν προεξοφλεί τη δημιουργία ΠΥΑ και ότι άλλοι παράγοντες, κυτταρικοί τύποι ή μηχανισμοί ευθύνονται για τη «μετάβαση» της ανεπίπλοκης ψευδόφακης αποκόλλησης σε αποκόλληση με ΠΥΑ. Τα ανοσοϊστοχημικά ευρήματα του υαλοειδούς ασθενών, που αντιμετωπίστηκαν με βιτρεκτομή, λόγω ψευδόφακης αποκόλλησης, ενισχύουν την εγκυρότητα των ευρημάτων στο ηλεκτρονικό μικροσκόπιο, σύμφωνα με τα οποία, υπάρχουν στοιχεία επιθηλιακής παρουσίας καθώς και κυττάρων γλοίας στο υαλοειδές των ασθενών αυτών. H απουσία λεμφοκυττάρων και πλασμοκυττάρων στο υαλοειδές ασθενών με αποκόλληση χωρίς ΠΥΑ, όπου στοιχεία επιθηλιακής παρουσίας υπάρχουν, ίσως να δείχνει προς την κατεύθυνση της άμεσης συμμετοχής του ανοσοποιητικού στη διαμόρφωση της ΠΥΑ και όχι προς αυτή ενός παράλληλου αποτελέσματος της εμπλοκής επιθηλιακών κυττάρων στη δημιουργία της. Η θετική χρώση για την anti-a-SMA σημαίνει αποδιαφοροποίηση και μεταπλασία των επιθηλιακών κυττάρων ή των κυττάρων γλοίας σε έναν τύπο πιο μεσεγχυματικό και την απόκτηση της ικανότητας σύσπασης του εξωκυτταρικού στρώματος, επομένως θα μπορούσαμε να θεωρήσουμε τον παράγοντα της θετικότητας στην anti-a-SMA, ως πιθανό παράγοντα κινδύνου για την εξέλιξη της ψευδοφακικής αποκόλλησης σε ΠΥΑ και επαναποκόλληση, χωρίς να γνωρίζουμε τα αίτια ή τη χρονική στιγμή κατά την οποία αναπτύχθηκαν συνθήκες ευνοϊκές για τη διαμόρφωση της παραπάνω επιπλοκής. Η στατιστικά σημαντική σχέση μεταξύ της αυξημένης έκφρασης της anti-GFAP στις επαμφιβληστροειδικές μεμβράνες ασθενών με ΠΥΑ και του ιστορικού προηγούμενου επιπωματισμού με σιλικόνη σημαίνει, ότι επιπλέον χειρουργικοί χειρισμοί, σε βαριά και πολύπλοκα περιστατικά αποκόλλησης με ΠΥΑ, πιθανά να λειτουργούν προσθετικά στην παθογένεια της ΠΥΑ. Το στατιστικά σημαντικό συμπέρασμα, που συνδέει με αντιστρόφως ανάλογο τρόπο το ιστορικό προηγούμενης ανεπιτυχούς εγχείρησης αποκόλλησης με την πρωτεΐνη CK19, δηλαδή συνδέει τη μετεγχειρητική ΠΥΑ με την πλημμελή συμμετοχή των επιθηλιακών κυττάρων του μελαγχρόου επιθηλίου στη διαμόρφωσή της, σημαίνει, ότι η αποδιαφοροποίηση, η μετανάστευση και ο πολλαπλασιασμός των επιθηλιακών κυττάρων του μελαγχρόου επιθηλίου δεν είναι οι αποφασιστικοί παράγοντες διαμόρφωσης της μετεγχειρητικής ΠΥΑ, οπότε ο ρόλος των αμφιβληστροειδικών κυττάρων γλοίας στο σχηματισμό των επαμφιβληστροειδικών μεμβρανών στην προχωρημένη ΠΥΑ έχει σίγουρα υποτιμηθεί και απαιτείται ο επαναπροσδιορισμός του. Τέλος, η μη αποκατάσταση της αποκόλλησης του αμφιβληστροειδούς σε προηγούμενη εγχείρηση αποκόλλησης, ανεξάρτητα από το είδος της χειρουργικής τεχνικής, που εφαρμόστηκε (βιτρεκτομή ή εξωβολβική επέμβαση), αυξάνει την πιθανότητα ανάπτυξης ΠΥΑ. Όσο πολυπλοκότερα είναι τα χειρουργικά μέσα και οι τεχνικές (έλαιο σιλικόνης), που χρησιμοποιούνται για την επανακόλληση του αμφιβληστροειδούς, τα οποία υπήρξαν ανάλογα της βαρύτητας και της πολυπλοκότητας της αποκόλλησης, τόσο φαίνεται να αυξάνεται ο κίνδυνος διαμόρφωσης της μετεγχειρητικής ΠΥΑ.