Μορφολογική, ανοσοϊστοχημική και μοριακή διερεύνηση των αναπλαστικών λεμφωμάτων (ALCL)

Abstract

The systematic anaplastic lymphoma (ALCL) constitutes an infrequent type of T-cell lymphoma, which characteristically expresses the CD30/KM antigen. A high fraction of ALCL expresses the anaplastic lymphoma kinase (ALK). Primary cutaneous anaplastic lymphoma (C-ALCL) is a T-cell lymphoma, which belongs in the group of T-cell lymphoproliferative disorders. Recently, the ALCL, ALK+ constitutes an autonomous category in the newer WHO classification, where they were apart from the ALCL, ALK- group of tumors. The ALCL, ALK+ tumors show very often the chromosomal translocation t(2;5) (p23;q35) between the NPM and ALK genes that leads to the creation of the “chimeric” gene, NPM-ALK, that is capable to drive oncogenesis. Variant translocation involving ALK and other genes has also reported. The aim of present study was to investigate in a series of 45 cases ALCL biopsies, from 42 patients the profile of genetic/molecular changes in combination with classic parameters that studied in the ALCL. More specifically, the ALK1 protein expression with IHC, the presence of t(2;5)(p23;q35) with RT-PCR and the rearrangements and/or chromosomal aberrations of ALK gene with FISH. The chromosome 2 status was also investigated with the centromeric 2 FISH probe. PCR, for the presence of T-cell receptor γ clonality performed. Probes for the identification of mRNAs containing (Bplus) and lacking (Bdel) exons 7 and 8 of the hTERT were studied with RT-PCR and 1SH, while the hTERT protein with IHC. Cyclin D1 was investigated with simple-and-double IHC at the protein level using two monoclonal antibodies, cyclin D1 mRNA, with ISH and RT-PCR and the CCND1 gene with FISH. Besides the above-mentioned methods, in the case of CCND1, the FICTION method was also applied. Fascin and MUC-1 proteins were also investigated. The IHC and in situ techniques were realised in the majority of cases in TMA sections, a modem technique, which allowed an important reduction of cost, time, and tissue material. From our study resulted the following observations and conclusions: 1) The molecular techniques (RT-PCR and FISH) used for detection of abnormalities of ALK gene showed a very high specificity to detect positive cases that are negative in the IHC for ALK1. 2) The systemic ALCLs present often gain of chromosome 2 that can be observed with the FISH assay. 3) The chromosomal aberration concerning polysomy of CCND1 gene and trisomy/polysomy of chromosome 11 detected in ALCLs is probably a consequence of the commonly observed polyploidy in this group of tumors. 4) Cyclin D1 mRNA is often expressed in ALCL, mostly related to the presence of translocations involving the ALK gene and to systemic disease. 5) The observed aberrations concerning CCND1 gene and cyclin D1 mRNA do not result in the production of functional Cyclin D1 protein, which, therefore, does not seem to play a role in the proliferation of ALCL. 6) The present study provides evidence that a decline in the overall expression of the B-deleted hTERT variant is found in ALCL cells, and in a higher incidence in the ALK translocation positive subgroup. Given the generally good prognosis of ALK positive ALCL, it appears unlikely that hTERT expression in ALCL is related to the prognosis of these tumors. The absence of hTERT expression in more than one-third of ALK negative ALCL may help to further refine tumor categorization in this heterogeneous lymphoma group. Importantly, the data presented here on hTERT variant mRNA expression were obtained by in situ approaches that can be further used to study respective alterations in a variety of lymphomas, where hTERT assessment in tissue extracts with RT-PCR based methods is likely to produce erroneous results. 7) Fascin overexpression mainly in the systemic ALCL probably contributes in invasiveness and systemic disease. 8) We observed significant differences in expression of MUC-1 protein in ALCL affecting younger individuals (≤ 35 years of age) and between systemic ALCL, ALK+ and ALCL, ALK-. The absence of MUC-I is probably theoretically related with better biological behavior, due to low resistance in chemotherapeutic agents.

Το συστηματικό αναπλαστικό λέμφωμα από μεγάλα κύτταρα (Σ-ΑΛΜΚ) αποτελεί σπάνιο Τ-κυτταρικής αρχής λέμφωμα, από μεγάλα λεμφοειδή κύτταρα και χαρακτηριστικά εκφράζει το αντιγόνο CD30/Ki-1. Μεγάλο ποσοστό των Σ-ΑΛΜΚ εκφράζουν την κινάση του αναπλαστικού λεμφώματος (ALK-anaplastic lymphoma kinase). Το πρωτοπαθές δερματικό αναπλαστικό λέμφωμα από μεγάλα κύτταρα (ΠΔΑΛΜΚ) είναι επίσης ένα Τ-κυτταρικής αρχής λέμφωμα του δέρματος, το οποίο ανήκει στις λεγάμενες πρωτοπαθείς δερματικές CD30+ Τ-κυτταρικής αρχής λεμφοϋπερπλασίες. Πρόσφατα, τα ΑΛΜΚ, ALK+ αποτελούν αυτόνομη κατηγορία στη νεώτερη κατάταξη της Π.Ο.Υ., όπου και διαχωρίσθηκαν από τα ΑΛΜΚ, ALK-. Τα ΑΛΜΚ, ALK+ εμφανίζουν πολύ συχνά την μετάθεση t(2;5)(p23;q35) μεταξύ των ΝΡΜ και ALK γονιδίων που οδηγεί στην δημιουργία ενός νέου «χιμαιρικού» γονιδίου, του ΝΡΜ-ALK, που δύναται να προκαλέσει ογκογένεση. Εκτός από την παραπάνω μετάθεση, έχουν αναφερθεί σε ποσοστό περίπου 20% των Σ-ΑΛΜΚ και άλλες 9 μεταθέσεις που εμπλέκουν το γονίδιο της ALK. Ο σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν να διερευνηθούν σε μια σειρά 45 περιπτώσεων ΑΛΜΚ, T-Null-κυτταρικής αρχής, από 42 ασθενείς το προφίλ των γενετικών/μοριακών αλλαγών σε σχέση με κλασσικές παραμέτρους που μελετιόνται στα ΑΛΜΚ. Ειδικότερα μελετήθηκαν με μεθόδους ανοσοϊστοχημείας (ΑΙΧ) η ALK πρωτεΐνη, ανάστροφης αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (RT-PCR) η μετάθεση t(2;5)(p23;q35) και φθορίζοντος υβριδισμό in situ (FISH) οι μεταθέσεις και χρωμοσωμικές ανωμαλίες του ALK γονιδίου. Διερευνήθηκε επίσης, με PCR, η παρουσία ανασυνδυασμού του Τ-κυτταρικού υποδοχέα τύπου γ (TCR-γ, T-cell receptor γ). Επιμέρους στόχους αποτέλεσαν η διερερεύνηση της έκφρασης των ισομορφών (mRNA) και της πρωτεΐνης hTERT, η διερεύνηση του γονιδιακού προφίλ του CCND1 γονιδίου, της έκφρασης του mRNA της cyclin Dl και της πρωτεΐνης Cyclin Dl με ΑΙΧ, καθώς και η ανίχνευση της πρωτεϊνικής έκφρασης των Fascin και MUC-1 (EMA, CD227) με ΑΙΧ. Επιπρόσθετα, στην περίπτωση της μελέτης του CCND1, εφαρμόσθηκε η μέθοδος της ταυτόχρονης φθορίζουσας ανοφαινοτυπικής και γονιδιακής ανάλυσης (FICTION). Οι ανοσοϊστοχημικές και in situ τεχνικές πραγματοποιήθηκαν στην πλειονότητα των περιπτώσεων σε ιστικές μικροσυστοιχίες (ΤΜΑ), μία σύγχρονη τεχνική, η οποία επέτρεψε την σημαντική μείωση του κόστους, του χρόνου, και του χρησιμοποιούμενου βιοπτικού υλικού της μελέτης. Τα αποτελέσματα συσχετίσθηκαν με γνωστές κλινικοπαθολογικές παραμέτρους. Από την μελέτη μας προέκυψαν οι εξής παρατηρήσεις και συμπεράσματα: 1) Οι μοριακές τεχνικές ανίχνευσης (RT-PCR και FISH) των ανωμαλιών του ALK γονιδίου συνδυαστικά ή και μεμονωμένα εμφανίζουν υψηλή ειδικότητα και μπορούν να αναδείξουν θετικές περιπτώσεις, οι οποίες είναι αρνητικές στην ανοσοϊστοχημεία για την ALK1. 2) Τα ΑΛΜΚ και ειδικότερα τα Σ-ΑΛΜΚ εμφανίζουν συχνά επαύξηση του χρωμοσώματος 2 με τη μέθοδο FISH χωρίς διευκρινισμένη έως τώρα παθογένεση και κλινική σημασία. 3) Η χρωμοσωμική ανωμαλία που σχετίζεται με την πολυσωμία του γονιδίου CCND1 και η τρισωμία/πολυσωμία του χρωμοσώματος 11 που ανευρέθη στο 39% των ΑΛΜΚ της μελέτης μας, πιθανώς είναι συνέπεια της συνήθους παρατηρούμενης ανευπλοειδίας σε αυτά τα νεοπλάσματα. 4) To mRNA της Cyclin Dl εκφράζεται σε υψηλό ποσοστό των ΑΛΜΚ (71%), συχνότερα στην ομάδα των ΑΛΜΚ με χρωμοσωμικές ανωμαλίες του ALK γονιδίου καθώς και στις περιπτώσεις συστηματικής νόσου. 5) Παρά την επαύξηση του CCND1 γονιδίου και την έκφραση του mRNA της Cyclin Dl, δεν παρατηρήθηκε σε καμία ΑΛΜΚ περίπτωση λειτουργική Cyclin Dl πρωτεΐνη, η οποία επομένως, δεν φαίνεται να διαδραματίζει ρόλο στην ανάπτυξη των ΑΛΜΚ. 6) Στη μελέτη μας παρατηρήσαμε μειωμένη έκφραση του Bdel hTERT mRNA και υψηλότερη συχνότητα του Bplus hTERT mRNA. Λαμβάνοντας υπόψη την γενικά καλή πρόγνωση των ΑΛΜΚ, ALK+, φαίνεται απίθανο ότι η έκφραση της hTERT σχετίζεται με την πρόγνωση αυτών των νεοπλασμάτων. Η απουσία έκφρασης της hTERT σε περισσότερο από το ένα τρίτο των ΑΛΜΚ, ALK - μπορεί να βοηθήσει στην περαιτέρω κατηγοριοποίηση της ετερογενούς αυτής ομάδας λεμφωμάτων. Στα σημαντικά στοιχεία της μελέτης μπορεί να θεωρηθεί και η ανίχνευση των εναλλακτικά ματισμένων μορφών της hTERT με in situ τεχνικές. Οι τεχνικές αυτές μπορούν να χρησιμοποιηθούν περαιτέρω σε μελέτες λεμφωμάτων, όπου η αξιολόγηση της hTERT στα εκχυλίσματα ιστών με βασισμένες στην RT-PCR τεχνικές είναι πιθανό να παράγουν λανθασμένα αποτελέσματα. 7) Η υπερέκφραση της Fascin κατά κύριο λόγο στα Σ-ΑΛΜΚ έναντι των ΠΔΑΛΜΚ, πιθανότατα αποτελεί ένδειξη της επιθετικότερης βιολογικής συμπεριφοράς του νεοπλάσματος. 8) Στη μελέτη μας παρατηρήσαμε διαφορά ως προς την έκφραση της πρωτεΐνης MUC-1 σε όγκους ασθενών νεαρής ηλικίας (≤35 έτη) σε σχέση με τους >35 έτη και στα Σ-ΑΛΜΚ, ALK+ έναντι των Σ-ΑΛΜΚ, ALK-. Οι παραπάνω διαφορές ίσως σχετίζονται με δυσμενέστερη βιολογική συμπεριφορά, θεωρητικά λόγω της αντίστασης στα χημειοθεραπευτικά των νεοπλασμάτων που εκφράζουν την ως άνω πρωτεΐνη.