Μοριακή τυποποίηση στελεχών ειδών candida από συστηματικές μυκητιάσεις ανοσοκατασταλμένων ασθενών

Abstract

During the last two decades, fungal infections caused by species of the genus Candida have turned out as a major medical as well as social problem in many countries of the Western World. It is thus imperative for the clinician as well as molecular biologist to come up with alternative and accurate laboratory solutions in terms of identification of the pathogenic fungus at the species level. In the present study, specific regions of the Candida genome were selected and analysed by use of a combined molecular methodology, with the hope of finding appropriate molecular markers for prompt identification of different Candida isolates both in terms of genus and species level. The conserved 5S rDNA genomic region together with the hypervariable ITS 1 and ITS 2 genomic regions, belonging to the rDNA genomic complex of the Candida genome, were analyzed by PCR and SSCP methods. These genomic markers were initially tested in 218 confirmed fungal isolates of the genus Candida belonging to the National Collection of Pathogenic Fungi (WFCC 2023) of the Mycology Reference Laboratory (Medical School, University of Athens) and afterwards in 108 biochemically confirmed Candida isolates from 64 immunocompromised and 22 non-immunosuppressed patients with confirmed or probable systematic infection by different Candida species, hospitalised in a central tertiary hospital in Athens. Molecular analysis of the 5S rDNA genomic region revealed a high discriminatory power (0.91), allowing the identification of 10 out of 11 different Candida species tested (C. albicans, C. parapsilosis, C. glabrata, C. tropicalis, C. krusei, C. rugosa, C. kefyr, C. pulcherimma, C. famata and C. guilliermondii). The SSCP banding pattern of C. dubliniensis was identical with C. albicans, rendering unable the identification at the molecular level. Sequencing results of the 10 species mentioned above revealed 8 cases of new sequences (all except C. albicans and C. parapsilosis). Furthermore, the same methodology was successfully tested in mixed DNA samples from 2 or 3 different Candida species. The ITS 1 genomic region was found to be conserved in C. albicans and hypervariable for C. tropicalis (4 SSCP subtypes) and C. parapsilosis (4 SSCP subtypes). On the other hand, the ITS 2 genomic region was found hypervariable in C. albicans with 8 SSCP subtypes, 5 of which were first described. The results of this study point out to 5S rDNA genomic region as an appropriate molecular marker for identification of different species of the genus Candida by use of the PCR-SSCP combined methodology. The ITS 2 genomic region can serve as a valuable diagnostic as well as epidemiological marker for identification of different C. albicans subtypes. On the other hand, ITS 1 region seems promising in identification of non-C. albicans subtypes, whereas this region appears highly conserved in C. albicans isolates. In terms of distribution of the 108 clinical samples of this study, 55% was C. albicans, 21% C. tropicalis and 9% C. glabrata. Patients hospitalized in the ICU or critically ill patients developed higher frequency of non-C.a fungal infections, whereas C.a isolates were found with greater abundance in immunocompromised patients. The results of this study showed C. tropicalis as the most abundant non-C.a species, especially amongst immunocompromised patients. It is of interest to note the elevated percentage of non-C.a isolates in the diseased patients and especially of C. krusei isolates (15%). More than one different Candida species were isolated in 18.6% of the total patient number and in 75% of the patients coexistence of fungal and bacterial infection was noted. Finally, it would be interesting from a clinical point of view to test specific C. albicans molecular subtypes in relation to resistance to specific antifungal drugs.

Οι μυκητιακές λοιμώξεις, ιδίως οι λοιμώξεις από είδη Candida, αναδεικνύονται πλέον σε μείζον ιατρικό και κοινωνικό πρόβλημα, που απαιτεί ταχεία και επακριβή αναγνώριση του παθογόνου μύκητα. Στην παρούσα μελέτη αναλύθηκαν με μοριακή μεθοδολογία επιλεγμένες γενετικές περιοχές των Candida-yονιδιωμάτων, προκειμένου να χρησιμοποιηθούν ως μοριακοί δείκτες ταυτοποίησης και τυποποίησης των διαφόρων στελεχών Candida. Η γονιδιακή περιοχή 5S rDNA (συντηρημένη περιοχή) και οι διαγονιδιακές περιοχές ITS 1 και ITS 2 (μεταβλητές περιοχές) του rDNA γονιδιακού συμπλέγματος της Candida μελετήθηκαν με συνδυαστική μεθοδολογία PCR-SSCP και νουκλεοτιδική ανάλυση των SSCPs. Οι γονιδιωματικοί αυτοί δείκτες μελετήθηκαν σε δείγματα DNA 218 ταυτοποιημένων στελεχών Candida της Εθνικής Συλλογής Παθογόνων Μυκήτων (WFCC 2023) και σε δείγματα DNA 108 βιοχημικώς ταυτοποιηθέντων στελεχών Candida, που απομονώθηκαν από 64 ανοσοκατασταλμένους και 22 μη ανοσοκατασταλμένους υπερήλικους ασθενείς με επιβεβαιωμένη ή πιθανή συστηματική λοίμωξη από Candida. Η μοριακή ανάλυση της περιοχής 5S rDNA εμφάνισε υψηλή διακριτική ικανότητα (0,91) και επέτρεψε την ταυτοποίηση των 10 από τα 11 είδη Candida που εξετάσθηκαν. Συγκεκριμένα, ταυτοποιήθηκαν τα στελέχη C. albicans, C. parapsilosis, C. glabrata, C. tropicalis, C. krusei, C. rugosa, C. kefyr, C. pulcherimma, C. famata και C. guilliermondii. H C. dubliniensis δεν ταυτοποιήθηκε λόγω προσόμοιου ηλεκτροφορητικού προτύπου με αυτό της C. albicans. Στα 10 ταυτοποιηθέντα είδη Candida βρέθηκαν, κατά τη νουκλεοτιδική ανάλυση, 8 νέες αλληλουχίες μη περιγραφείσες διεθνώς. Επιτυχής ταυτοποίηση στελεχών έγινε και σε μικτά δείγματα που περιείχαν 2 ή 3 διαφορετικά είδη Candida. Η ανάλυση της περιοχής ITS 1 έδειξε ότι η διαγονιδιακή αυτή περιοχή είναι εξελικτικά συντηρημένη στην C. albicans και μεταβλητή στην C. tropicalis (4 υπότυποι) και C. parapsilosis (4 υπότυποι). Αντίθετα, η περιοχή ITS 2 βρέθηκε στην C. albicans με 8 διακριτούς υπότυπους, εκ των οποίων οι 5 ήταν πρωτοπεριγραφόμενοι. Τα αποτελέσματα της μελέτης αυτής καταδεικνύουν ότι περιοχή 5S rDNA προσφέρεται, κατά την PCR-SSCP ανάλυση, ως μοριακός δείκτης ταυτοποίησης των διαφόρων ειδών Candida. Η ανάλυση της περιοχής ITS 2 εμφανίζεται ως πολύτιμος μοριακός δείκτης, διαγνωστικά και επιδημιολογικά, για την αναγνώριση των διαφόρων υπότυπων της C. albicans. Αντίθετα, η ανάλυση της περιοχής ITS 1 δεν προσφέρεται για τυποποίηση C. albicans στελεχών, ενώ ενδεχομένως προσφέρεται για αναγνώριση υπότυπων μη-C albicans στελεχών. Από τα 108 ταυτοποιηθέντα στελέχη Candida, που απομονώθηκαν σε κλινικά δείγματα, 55% ήταν C. albicans, 21% C. tropicalis και 9% C. glabrata. Η ανάπτυξη λοιμώξεων από μη-C.a είδη βρέθηκε αυξημένη σε ασθενείς με βαριά κλινική κατάσταση και σε ασθενείς που νοσηλεύθηκαν στη ΜΕΘ. Στους ανοσοκατασταλμένους ασθενείς υπερείχαν οι λοιμώξεις από C.a στελέχη και επισημάνθηκαν λοιμώξεις από ασυνήθη μη-C.a είδη. Σε αντίθεση προς τα επιδημιολογικά στοιχεία πολλών μελετών, στην παρούσα μελέτη η C. tropicalis εμφανίσθηκε ως το συχνότερο μη-C.a είδος, ιδίως μεταξύ των μη ανοσοκατασταλμένων ασθενών. Σε σχέση με την κλινική έκβαση των ασθενών, επισημαίνεται το αυξημένο ποσοστό μη-C.a στελεχών στους θανόντες ασθενείς και κυρίως η αυξημένη παρουσία C. krusei στελεχών (15%). Περισσότερα του ενός είδη Candida απομονώθηκαν στο 18,6% των ασθενών (75% με συνύπαρξη βακτηριακής λοίμωξης). Περαιτέρω συσχέτιση ορισμένων μοριακών υπότυπων της C.a με αντίσταση σε αντιμυκητιακά φάρμακα θα ήταν ιδιαίτερης κλινικής χρησιμότητας.