Μελέτη των μηχανισμών παθογένεσης του ιού HIV-1

Abstract

The human immunodeficiency virus (HIV) is responsible for the development of the acquired immunodeficiency syndrome (AIDS). The hallmark of the HIV infection is the depletion of memory/effector CD4/CD45RO T cells during the asymptomatic phase that leads to the deregulation of the immune system. The exact mechanism of CD4 T lymphocyte depletion is not well understood. Although several hypotheses have been proposed to explain this aspect of HIV pathogenesis, the prevailing theory is that chronic activation of the immune system by the HIV infection causes exhaustion of CD4 T cells that die by activation induced cell death (AICD). In order to investigate the mechanism by which HIV generates AICD to memory/effector CD4/CD45RO T cells we developed an in vitro system using human primary cells isolated from healthy donors. Since the major role of memory/effector CD4/CD45RO T cells is to recognize antigens on antigen presenting cells (APC) and regulate the appropriate immune response, we studied the pathogenic mechanism from an immunological point of view. We investigated the effects of the third hypervariable region (V3) of the envelope glycoprotein gp120 of HIV-1 during the antigen presentation process. Using composite liposome particles with exposed V3 synthetic lipopeptides, we demonstrated that during antigen presentation, when the V3 epitope was present on the surface of APC, interacted at least with the chemokine receptor CCR5, causing enhanced proliferation followed by sharp apoptosis of the responding T lymphocytes. The main objective of the present study was to identify the intracellular signals generated by the V3 phenomenon. The responding tetanus-specific memory CD4/CD45RO T cells have an anticipated frequency in the order of 1 in 10⁵ - 10⁶ T cells. This low frequency was considered unsuitable for the required intracellular signaling studies and the V3 phenomenon had to be adapted using a more general antigen induced activation system. For this reason the first part of this study dealt with the replacement of the tetanus specific model by a super antigen (SEA) that activates up to 25% of CD4 T cells to provide evidence that the V3 phenomenon occurred in the new system. Proliferation and apoptosis studies indicated that in the presence of SEA, V3 generated AICD. Phenotypic analysis of the cells confirmed that the main population affected was the CD4/CD45RO T cells that express the chemokine receptor CCR5 and are reported to be the target cell population of HIV during the asymptomatic phase. Removal of CD8 cells, as SEA activates both CD4 and CD8 cells, improved the observed V3 phenomenon in terms of both clarity and repeatability indicating that this phenomenon is restricted to CD4 cells. Addition of IL-2, but not IL-4, further improved the proliferation and the apoptosis of the responding cells. PBMCs incubated with IL-2 in the absence of SEA were also affected by the presence of V3 indicating a possible involvement of IL-2 in the V3 phenomenon. Further experiments were conducted in order to identify other cell surface receptors for signal transduction. Our results showed an increase in the percentage of cells expressing the IL-2 receptor, CD25, and the Fas receptor (CD95). Both receptors are considered to be activation markers of antigen responding T cells and are involved in the proliferation (CD25) and apoptosis (CD95) of T cells. In the same context, measurements of intracellular calcium indicated that the presence of V3 increased the calcium levels at time points where maximum apoptosis and Fas expression were observed. Proliferation and apoptosis are dynamics states and although increase of intracellular calcium is required for cell proliferation, sustained increase may also lead to AICD. We finally investigated mRNA expression level changes in CD4 T cells after exposing them to the above described SEA-V3 liposome system in relation to SEA-plain liposome control. cDNA products were assessed by microarray analysis (Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array) with a panel of 47.500 transcripts of which 38.500 were genes of the human genome. Changes ≥2 (p≤0.05) were considered as significant. Our results showed that 378 genes were up-regulated and 61 genes down-regulated. The major clusters of these genes are involved in the activation of T cells and the increase in intracellular calcium levels. Nuclear factor of activated T-cells 5 (NFAT5), which is a transcription factor involved in the activation of T lymphocytes during antigen presentation, showed an 18-fold increase in mRNA levels is considered to have a crucial role in the activation of T cell induced by the V3 phenomenon. The microarray results were further evaluated by real time PCR that verified the increase in the mRNA levels of NFAT5. Up-regulation of CD38 gene, which is involved in increasing the intracellular calcium levels, was verified by phenotypic analysis on CD4/CD45RO T cells that showed increased levels of CD38 expression at time points where increased levels of intracellular calcium and maximum apoptosis were observed. The above results indicated a possible mechanism for the V3 phenomenon. During antigen presentation, V3 peptides positioned on the surface of APC, interact with at least the chemokine receptor CCR5 on the surface of CD4 T cells and generate AICD. Because of the position of the V3 peptides on the surface of APC and the ionic interaction between the V3 peptides and the CCR5 chemokine receptor, it is believed that this interaction strengthens the contact between APC and T cells, and prolongs the duration of antigen presentation. This generates enhanced activation signaling on T cells with subsequent increase in intracellular calcium that leads to the activation of NFAT5 transcription factor. NFAT5 activates T cells leading to enhanced proliferation and expression of activation markers such as CD25, CD38, CD95 and increased levels of intracellular calcium. The abnormal enhanced activation produced by prolonged signaling during the antigen presentation leads to the cell death of CD4 T cells by AICD. Understanding the pathogenesis of HIV is crucial for the rational design of more effective antiretroviral therapy. In this sense, the use of synthetic peptides with positively charged amino acids that inhibited cell proliferation caused by the V3 phenomenon may prove to be a useful tool for the battle against HIV. Additionally identification of the key factors in the signal transduction system of the cells that are modulated by HIV may assist in recognizing new therapeutic targets.

Ο ιός της ανθρώπινης ανοσοανεπάρκειας (HIV) είναι ο αιτιολογικός παράγοντας για την επίκτητη ανοσολογική ανεπάρκεια (AIDS). Το κύριο χαρακτηριστικό της μόλυνσης με τον ιό είναι η ελάττωση των μη μολυσμένων ενεργοποιημένων/αναμνηστικών CD4/CD45RO T κυττάρων κατά την ασυμπτωματική φάση που οδηγεί στην δυσλειτουργία του ανοσοποιητικού συστήματος. Ο ακριβής μηχανισμός της ελάττωσης των CD4 T κυττάρων δεν είναι ακόμα κατανοητός παρόλο που αρκετοί ιικοί παράγοντες έχουν προταθεί να επάγουν τον θάνατο των κυττάρων. Προκειμένου να διερευνηθεί η παθογένεση του HIV και να ερευνηθεί ο μηχανισμός με τον οποίον προκαλεί τον κυτταρικό θάνατο επαγόμενο από ενεργοποίηση των ενεργοποιημένων/αναμνηστικών CD4/CD45RO T κυττάρων αναπτύξαμε ένα in vitro σύστημα χρησιμοποιώντας ανθρώπινα πρωτογενή κύτταρα από υγιείς δότες. Εφόσον η κύρια λειτουργία αυτών των κυττάρων είναι η αλληλεπίδραση τους με αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα μελετήσαμε την παθογένεια του HIV από μια καθαρά ανοσολογική σκοπιά. Προγενέστερες μελέτες της ερευνητικής μας ομάδας έδειξαν ότι κατά την διάρκεια της αντιγονοπαρουσίασης η τρίτη μεταβλητή (V3) περιοχή της γλυκοπρωτεΐνης gp120 όταν βρίσκεται στην επιφάνεια των αντιγονοπαρουσιαστικών κυττάρων, αλληλεπιδρά τουλάχιστον με τον υποδοχέα χημειοκινών CCR5 στην επιφάνεια των Τ κυττάρων, και προκαλεί κυτταρικό θάνατο επαγόμενο από ενεργοποίηση στα απαντώντα Τ κύτταρα. Ως αντιγόνο, για την ενεργοποίηση των κυττάρων, είχε χρησιμοποιηθεί το τοξοειδές του τετάνου με μια συχνότητα 1 στα 10⁵ - 10⁶ Τ κύτταρα. Κεντρικός στόχος της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν να εντοπιστούν τα ενδοκυτταρικά μονοπάτια που μπορεί να διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στο V3 φαινόμενο. Το πρώτο μέρος της μελέτης ήταν να αντικατασταθεί το τετανοειδικό σύστημα, λόγω της μικρής συχνότητας των απαντούντων Τ κυττάρων, από το υπερ-αντιγόνο SEA το οποίο ενεργοποιεί περίπου το 25% των CD4 T κυττάρων. Μελέτες πολλαπλασιασμού και μετρήσεις της απόπτωσης των κυττάρων έδειξαν ότι το V3 φαινόμενο διατηρείται στο σύστημα του SEΑ. Φαινοτυπικός προσδιορισμός με κυτταρομετρία ροής έδειξε ότι ο κύριος υποπληθυσμός των Τ κυττάρων είναι τα CD4/CD45RO T κύτταρα που εκφράζουν τον υποδοχέα CCR5 και αντιστοιχούν στον υποπληθυσμό των Τ κυττάρων που ελαττώνεται κατά την ασυμπτωματική φάση της HIV μόλυνσης. Πειράματα βελτιστοποίησης του φαινομένου συμπεριέλαβαν την απομόνωση των CD8 T κυττάρων από τα PBMC, και την επώαση των κυττάρων με ιντερλευκίνη-2 (IL-2) και ιντερλευκίνη-4 (IL-4). Εξαιτίας του τρόπου δράσης του υπερ-αντιγόνου η επώαση των κυττάρων είχε ως αποτέλεσμα την ενεργοποίηση και των CD8 και των CD4 T κυττάρων. Απομόνωση των CD8 κυττάρων από τα PBMC βελτιστοποίησε το V3 φαινόμενο ενισχύοντας προηγούμενες παρατηρήσεις ότι το φαινόμενο παρατηρείται μόνο στα CD4 Τ κύτταρα. Επώαση των κυττάρων με IL-2, αλλά όχι με IL-4, ενίσχυσε τον πολλαπλασιασμό και την απόπτωση των κυττάρων. Περαιτέρω πειράματα για τον εντοπισμό των ενδοκυτταρικών μονοπατιών του V3 φαινομένου έδειξαν αύξηση του υποδοχέα της ιντερλευκίνης-2, CD25, και του υποδοχέα Fas (CD95). Και οι δύο υποδοχείς θεωρούνται ως μάρτυρες ενεργοποίησης των Τ κυττάρων, όταν αυτά ενεργοποιηθούν από την αναγνώριση κάποιου αντιγόνου, και διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στον πολλαπλασιασμό και την απόπτωση των κυττάρων. Μέτρηση των επιπέδων mRNA του μεταγραφικού παράγοντα YY1, ο οποίος εκτός των άλλων ρυθμίζει αρνητικά την έκφραση των υποδοχέων Fas και CCR5, έδειξε μείωση των επιπέδων του. Επίσης κινητική ανάλυση των επιπέδων ενδοκυτταρικού ασβεστίου έδειξε αυξημένα επίπεδα ασβεστίου σε χρονικές περιόδους που παρατηρείται αύξηση του υποδοχέα Fas και της μέγιστης απόπτωσης. Η ισορροπία μεταξύ πολλαπλασιασμού και απόπτωσης είναι πολύ εύθραυστη και παρόλο που αύξηση των επιπέδων ασβεστίου είναι απαραίτητη για την ενεργοποίηση των κυττάρων, παρατεταμένη αύξηση οδηγεί στην απόπτωση των κυττάρων. Για να ερευνήσουμε τα πρωταρχικά σηματοδοτικά μονοπάτια που προκαλούν το V3 φαινόμενο πραγματοποιήθηκαν μικροσυστοιχίες συμπληρωματικού DNA. Η ανάλυση των αποτελεσμάτων ανέδειξε 378 γονίδια με αυξημένα και 61 με μειωμένα επίπεδα RNA (p≤0.05). Η πλειοψηφία των γονιδίων σχετίζεται με ενεργοποίηση των κυττάρων και αύξηση των επιπέδων ενδοκυτταρικού ασβεστίου. Από αυτά ο μεταγραφικός παράγοντας nuclear factor of activated T-cells 5 (NFAT5), ο οποίος εκτός των άλλων εμπλέκεται στην ενεργοποίηση των T κυττάρων κατά την διέγερση τους από αντιγονικά ερεθίσματα, παρουσίασε σημαντικό ενδιαφέρον και τα αποτελέσματα των μικροσυστοιχιών επαληθευτήκαν με αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης πραγματικού χρόνου. Επίσης φαινοτυπική ανάλυση επαλήθευσε τα αποτελέσματα των μικροσυστοιχιών και για τον υποδοχέα CD38. Ο υποδοχέας CD38 σχετίζεται με την αύξηση των επιπέδων ενδοκυτταρικού ασβεστίου και τα αποτελέσματα έδειξαν αύξηση της έκφρασης του υποδοχέα στα CD4/CD45RO T κύτταρα σε χρονικές περιόδους που παρατηρείται αύξηση των επιπέδων ενδοκυτταρικού ασβεστίου και μέγιστη απόπτωση. Η κατανόηση του μηχανισμού παθογένειας του ιού HIV συμβάλει στον αποτελεσματικότερο σχεδιασμό αντιρετροϊκής θεραπείας. Σε αυτό το μήκος κύματος συνθετικά πεπτίδια με 9 αρνητικά φορτισμένα πεπτίδια ανέστειλαν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων που προκλήθηκε από το V3 φαινόμενο και ενδεχομένως να αποτελέσουν μελλοντικό εργαλείο για την αποτελεσματική καταπολέμηση της HIV μόλυνσης.