Κατασκευή φυσικού και αιμοποιητικού μεταγραφικού χάρτη της περιοχής 5q23-31 του ανθρώπου - απομόνωση και χαρακτηρισμός ενός νέου γονιδίου και του ομολόγου του στον ποντικό

Abstract

Acquired interstitial loss of distinct regions of the long arm of human chromosome 5 (5q-) represents one of the most frequent cytogenetic abnormalities associated with preleukemic and leukemic disorders. An exceptional number of important genes that code for hematopoietic growth factors, receptors or other regulatory molecules have been assigned to the region 5q23-31, which is frequently deleted in patients with myelodysplastic syndromes (MDS). The clustering of all these genes regulating hematopoiesis, cell growth and differentiation within this region has attracted extensive research on the involvement of this region in the pathogenesis of myelodysplastic syndromes. Despite years of mapping and definition of minimally deleted chromosomal regions on chromosome 5, no gene has been strongly associated with myelodysplastic syndromes and their evolution to acute leukemia. Independent studies based on series of informative patients, have identified several putative ‘critical subregions’ within the ‘critical region’ 5q23-31. The major aim of this thesis was the generation of a physical and transcript hematopoietic map of one of these ‘critical subregions’ within 5q23-31 and the identification of novel genes involved in normal hematopoiesis and putatively leukemogenesis. As a first step towards the elucidation of the role of this region in normal hematopoiesis and in leukemogenesis, in the present study we constructed a physical map of one of these ‘critical subregions’ encompassing the interleukin-3 (IL-3), granulocyte-macrophage colony stimulating factor (GM-CSF), interferon regulatory factor 1 (IRF1) and Τ-cell specific transcription factor 1 (TCF-1) genes. Extensive PCR screening of the CEPH and ICI YAC libraries as well as the RPCI1 PAC library, resulted in the isolation of a set of genomic clones that have been further characterized by STS mapping and Alu-PCR fingerprinting. The constructed contig encompasses a region of approximately 3 Mb. In order to develop a transcript map of this subregion, known genes and expressed sequence tags (ESTs) were selected on the basis of their origin from hematopoietic tissues. YAC contig clones analysis along with in silico comparative searches of human and mouse genomes, resulted in a complete hematopoietic transcript map of this subregion which shares substantial synteny with mouse 11B1.3, 18D3 and 13B1. Selected ESTs expression in bone marrow was documented by PCR. Subsequently, ESTs and I.M.A.G.E. cDNA clones were analysed by RACE-PCR on bone marrow, fetal liver cDNA libraries and sequencing. Moreover, we employed the NIX combination of database programs to identify putative exons and gene models of three P1 clones (AC005221, AC004507, AC006077). Several predicted exons have been extended by RACE-PCR on leukocyte and heart cDNA libraries, followed by expression profile analysis using PCR on a multiple tissue cDNA panel and Northern blot analysis. Genomic clone AC006077 analysis led to the isolation of a disulfide isomerase gene (C5orf14) from leukocyte and bone marrow cDNA libraries. Furthermore, C5orf14 gene expression was detected in placenta, pancreas, liver, heart, brain, lung, kidney, skeletal muscle, small intestine, colon, spleen and thymus. In addition, the expression of an adjacent, telomeric gene of an HNF-1α dimerization cofactor (PCBD2) has been established in leukocytes and bone marrow.

Η επίκτητη έλλειψη διακριτών ενδιάμεσων περιοχών του μακρού βραχίονα του χρωμοσώματος 5 αποτελεί μία από τις συχνότερες κυτταρογενετικές ανωμαλίες που απαντώνται στους ασθενείς με προλευχαιμικές και λευχαιμικές διαταραχές. Ένας μεγάλος αριθμός γονιδίων που κωδικοποιούν αιμοποιητικούς αυξητικούς παράγοντες, υποδοχείς αυξητικών παραγόντων ή άλλα ρυθμιστικά μόρια, έχει χαρτογραφηθεί στην περιοχή 5q23-31, η οποία συχνά εξαλείφεται στους ασθενείς με μυελοδυσπλαστικά σύνδρομα. Η συγκέντρωση μίας ποικιλίας γονιδίων που εμπλέκονται στην αιμοποίηση και στην κυτταρική αύξηση και διαφοροποίηση γενικότερα, οδήγησε σε εκτεταμένες έρευνες σχετικά με το ρόλο της περιοχής στην παθογένεση των μυελοδυσπλαστικών συνδρόμων. Ωστόσο, οι μακροχρόνιες προσπάθειες δεν αποκάλυψαν κανένα γονίδιο υπεύθυνο για τα μυελοδυσπλαστικά σύνδρομα και την εξέλιξή τους σε οξεία μυελογενή λευχαιμία. Ανεξάρτητες κυτταρογενετικές μελέτες δειγμάτων πληροφοριακών ασθενών υπέδειξαν την ύπαρξη μικρότερων δυνητικά “κρίσιμων” υποπεριοχών εντός της “κρίσιμης” περιοχής 5q23-31. Ο σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν η δημιουργία ενός φυσικού και μεταγραφικού αιμοποιητικού χάρτη της μίας από τις “κρίσιμες” υποπεριοχές της 5q23-31 και η ανίχνευση νέων γονιδίων που σχετίζονται με τη φυσιολογική αιμοποίηση και δυνητικά με τη λευχαιμογένεση. Με βάση τoν ανωτέρω σκοπό, αρχικά κατασκευάστηκε ο φυσικός χάρτης της μίας από τις “κρίσιμες” υποπεριοχές που περιλαμβάνει τα γονίδια της ιντερλευκίνης-3 (IL-3), του αυξητικού παράγοντα των κοκκιοκυττάρων-μακροφάγων (GM-CSF), του παράγοντα που ρυθμίζει τα γονίδια των ιντερφερονών τύπου 1 (IRF1) και του ειδικού μεταγραφικού παράγοντα των Τ-λεμφοκυττάρων 1 (TCF-1). Συγκεκριμένα, η μοριακή σάρωση κλώνων YACs των βιβλιοθηκών CEPH και ICI και κλώνων PΑCs της βιβλιοθήκης RPCI1 με την εφαρμογή της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR), οδήγησε στην ανίχνευση γενωμικών κλώνων που χαρακτηρίστηκαν περαιτέρω με τη χαρτογράφηση STSs και την εφαρμογή της Alu-PCR. Η σειρά των αλληλοεπικαλυπτόμενων κλώνων (contig) που προέκυψε εκτείνεται σε μία περιοχή περίπου 3 Mb. Προκειμένου να κατασκευαστεί ο μεταγραφικός χάρτης της υπό εξέταση περιοχής, επιλέχθηκαν γνωστά γονίδια και εκφραζόμενες αλληλουχίες ESTs που προέρχονταν από αιμοποιητικούς ιστούς. Η ανάλυση των κλώνων YACs σε συνδυασμό με τη συγκριτική μελέτη του γονιδιώματος του ανθρώπου και του ποντικού in silico, οδήγησε σε ένα πλήρη αιμοποιητικό χάρτη της περιοχής που παρουσιάζει αξιόλογη συγγραμμικότητα με τις περιοχές 11B1.3, 18D3 και 13B1 του ποντικού. Αφού πιστοποιήθηκε η έκφραση των επιλεγμένων ESTs στο μυελό των οστών, ακολούθησε η επέκταση της αλληλουχίας τους με την εφαρμογή της RACE-PCR σε βιβλιοθήκες cDNA μυελού των οστών και εμβρυϊκού ήπατος και προσδιορισμός της αλληλουχίας των αντίστοιχων κλώνων cDNA I.M.A.G.E. Επιπλέον, με την εφαρμογή του συνόλου των υπολογιστικών προγραμμάτων ΝΙΧ, αναλύθηκαν τρεις γενωμικοί κλώνοι Ρ1 (AC005221, AC004507, AC006077) ως προς την παρουσία δυνητικών εξωνίων και γονιδίων. Ορισμένα δυνητικά εξώνια επεκτάθηκαν με την εφαρμογή της RACE-PCR σε βιβλιοθήκες cDNA των λευκοκυττάρων και της καρδιάς. Ακολούθησε ανάλυση της έκφρασης των αλληλουχιών που προέκυψαν, με PCR σε μία σειρά βιβλιοθηκών cDNA και ανάλυση τύπου Νorthern.