Μελέτη κλώνων πικροδάφνης (Nerium oleander L.) για αντοχή σε υδατική καταπόνηση με εκτίμηση φυσιολογικών και βιοχημικών παραμέτρων

Abstract

Drought stress is a major limiting factor in crop production, causing changes in physiological and biochemical characteristics including photosynthesis, protein synthesis and compatible solute accumulation. Oleander (Nerium oleander L.) is a native evergreen shrub in the Mediterranean region, with high interest in landscaping due to its ornamental value and adaptation to low water availability. The aim of the thesis research was to study the response of oleander in drought by investigating physiological and biochemical parameters, as well as the ability for subsequent recovering. Two and 5-month-old plants, in two distinct experiments, from 9 clones of oleander (NO1, NO2, NO3, NO4, NO5, NO6, NO7, NO8 and NO9) were subjected in drought stress conditions, by withholding irrigation. Drought caused reduction of stomatal conductance (gs), net photosynthesis (A), transpiration rate (E) and substomatal CO2 concentration (Ci), while water use efficiency (WUE) was reduced only in NO7 plants. In contrast, electrolyte leakage, total protein content, sugar content and peroxidase specific activity (PA) increased in most cases. Chlorophyll and carotenoid content either increased or remained unchanged. Different response was observed among the clones regarding proline content and acid phosphatase specific activity (APA). The exposure of oleander plants to drought as well as to drought-recovering treatment resulted in increased intensity of protein bands and in the appearance of new protein bands. Different patterns of anionic and cationic peroxidase (A-POD and C-POD), superoxide dismutase (SOD), acid phosphatase (ACP), esterase (EST) and RNase isoforms were noticed among plant tissues and clones. Electrophoresis revealed new isoforms of all the above mentioned enzymes due to drought, not necessarily the same between different tissues and clones. No difference among water treatments was noticed in DNase patterns. One day after re-watering all plants recovered to their initial macroscopical state, regaining 80% of their water content, while gs, A, E, and Ci recovered to a different degree (except clone NO8 andNO2). The rest of the parameters either recovered or did not recover after re-watering. Pretreatment with Paclobutrazol (PBZ) did not have a positive effect on the physiological status of 4-month-old oleander plants (NO1, NO2 and NO3) subjected to water shortage for 50 days, but it caused reduction of WUE and a greater reduction of A. PBZ did not affect electrolyte leakage and sugar content, which however increased significantly due to water deficiency. Increased content of chlorophyll and PA was observed in PBZ treated leaves. Under normal watering regimes, PBZ caused the expression of new ACP and EST isoforms in oleander roots, which also appeared in stressed plants without PBZ. Drought stress caused by the addition of mannitol to the nutrient solution (0.2M, 0.4M and 0.6M), reduced fresh and dry weight, gs, A, E, and PA in root extracts of two oleander clones (NO8and NO9). On the other hand, PA in leaf and stem extracts and chlorophyll content increased significantly. Electrophoresis revealed different protein bands and different A-POD, C-POD, APX, SOD, ACP, EST, DNase and RNase isoforms, among plant tissues and oleander clones, as well as new isoforms due to osmotic stress, particularly in root extracts. One day after mannitol removal from the nutrient solution neither the plants recovered nor the physiological and biochemical parameters approached their initial state. The treatment of 5-month-old oleander plants (NO2 and NO3) with 2.5 mM salicylic acid (SA), grown in nutrient solution, caused the decrease of gs, A, E, chlorophyll and carotenoid content and the increase of PA. In osmotic stress conditions, caused by the addition of 15% PEG in the nutrient solution, SA intensified the loss of fresh weight and electrolyte leakage. In contrast, SA preserved WUE at high levels and increased chlorophyll and carotenoid content. Different impact of SA on A, proline and protein content, PA and APA was recorded between clones NO2 and NO3. Changes in bands intensity and induction of new A-POD, C-POD, APX, SOD, ACP and EST isoforms as well as new protein bands were observed in stressed and recovered plants. Certain A-POD, C-POD, APX and ACP isoforms which appeared as a result of osmotic stress also appeared in SA treated plants without PEG in the nutrient solution.

Η έλλειψη νερού είναι από τους πλέον περιοριστικούς παράγοντες της φυτικής παραγωγής προκαλώντας μεταβολές σε φυσιολογικά και βιοχημικά χαρακτηριστικά, που ποικίλλουν από τη φωτοσύνθεση έως τη σύνθεση πρωτεϊνών και τη συσσώρευση διαλυτών ουσιών. Η πικροδάφνη (Nerium oleander L.) είναι αυτοφυής αειθαλής θάμνος της Μεσογείου, με καλή προσαρμογή σε συνθήκες υδατικής καταπόνησης. Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η διερεύνηση της ανταπόκρισης της πικροδάφνης σε συνθήκες έλλειψης νερού, που προκλήθηκε με διάφορα μέσα, με τη βοήθεια φυσιολογικών και βιοχημικών παραμέτρων και της ικανότητάς της για ανάνηψη μετά την άρση της καταπόνησης. Φυτά πικροδάφνης ηλικίας δύο και πέντε μηνών, σε δύο ξεχωριστά πειράματα, από 9 κλώνους πικροδάφνης (ΝΟ1, ΝΟ2, ΝΟ3, ΝΟ4, ΝΟ5, ΝΟ6, ΝΟ7, ΝΟ8 και ΝΟ9), υποβλήθηκαν σε συνθήκες υδατικής καταπόνησης, που προκλήθηκε με διακοπή της άρδευσης. Η έλλειψη νερού προκάλεσε μείωση της στοματικής αγωγιμότητας στα φυτά όλων των κλώνων, που τις περισσότερες φορές συνοδεύτηκε από μείωση της φωτοσύνθεσης και διαπνοής καθώς και του Ci, και ορισμένες φορές από μη μεταβολή των παραμέτρων αυτών, ενώ ο λόγος Α/Ε μειώθηκε μόνο στα φυτά του κλώνου ΝΟ7. Αύξηση της διαρροής των ηλεκτρολυτών, της περιεκτικότητας σε ολικές πρωτεΐνες και σάκχαρα και της ειδικής ενζυμικής δραστικότητας των υπεροξειδασών σημειώθηκε στα φυτά των περισσότερων κλώνων. Επίσης, η περιεκτικότητα σε χλωροφύλλες και καροτινοειδή είτε αυξήθηκε είτε δεν επηρεάστηκε από την έλλειψη νερού. Διαφορετική ανταπόκριση μεταξύ των 9 κλώνων παρατηρήθηκε σε συνθήκες υδατικής καταπόνησης όσον αφορά την περιεκτικότητα των φύλλων και των ριζών σε προλίνη καθώς και την ειδική ενζυμική δραστικότητα των φωσφατασών. Η έλλειψη νερού επιπλέον είχε ως αποτέλεσμα την αύξηση της έντασης των πρωτεϊνικών ζωνών αλλά και την εμφάνιση νέων ζωνών κατά την SDS ηλεκτροφόρηση. Διαφορετική εικόνα των ισομορφών των ανιονικών και κατιονικών υπεροξειδασών (POD), της υπεροξειδάσης του ασκορβικού οξέος (APX), της υπεροξειδικής δισμουτάσης (SOD), των όξινων φωσφατασών (ACP), των εστερασών (EST) και των ριβονουκλεασών (RNασών) καταγράφηκε στους διάφορους ιστούς που μελετήθηκαν, διαφορετικών μεταξύ των κλώνων που αξιολογήθηκαν. Νέες ισομορφές των παραπάνω ενζύμων εμφανίστηκαν λόγω της έλλειψης νερού, όχι απαραίτητα οι ίδιες μεταξύ των διαφορετικών ιστών και κλώνων. Εξαίρεση αποτέλεσε η έκφραση των δεοξυριβονουκλεασών (DNασών), όπου δεν ανιχνεύθηκε διαφοροποίηση, τόσο μεταξύ των μεταχειρίσεων όσο και μεταξύ των φυτικών ιστών. Μία ημέρα μετά την έναρξη της άρδευσης τα φυτά και των 9 κλώνων, με βάση τα μακροσκοπικά τους χαρακτηριστικά, επανήλθαν στην αρχική τους μορφολογική κατάσταση, ανέκτησαν το 80% της περιεκτικότητας των φύλλων τους σε νερό, ενώ ταυτόχρονα αλλά σε διαφορετικό βαθμό επανήλθαν στα αρχικά επίπεδα που είχαν πριν από την έναρξη της υδατικής καταπόνησης η στοματική αγωγιμότητα, η φωτοσύνθεση (εκτός των κλώνων ΝΟ8 και ΝΟ2), η διαπνοή καθώς και το Ci. Στο στάδιο της ανάνηψης, η μεταβολή των υπολοίπων παραμέτρων διέφερε ανάλογα με τον κλώνο, που άλλοτε επανερχόταν στα επίπεδα του μάρτυρα και άλλοτε όχι. Η προ μεταχείριση με 100 ppm Paclobutrazol (PBZ) σε φυτά πικροδάφνης ηλικίας 4 μηνών των κλώνων ΝΟ1, ΝΟ2 και ΝΟ3, δεν επέφερε την αναμενόμενη προστατευτική δράση, αντίθετα προκάλεσε μεγαλύτερη μείωση της φωτοσύνθεσης σε όλους τους κλώνους και μείωση του λόγου Α/Ε στους κλώνους ΝΟ1 και ΝΟ3, μετά από 50 ημέρες έλλειψης νερού. Αυξημένη περιεκτικότητα χλωροφυλλών και ειδική ενζυμική δραστικότητα των υπεροξειδασών στα φύλλα σημειώθηκε στην μεταχείριση της υδατικής καταπόνησης λόγω της εφαρμογής ΡΒΖ. Η χρήση ΡΒΖ δεν επηρέασε την μεταβολή της διαρροής των ηλεκτρολυτών καθώς και της περιεκτικότητας σε σάκχαρα που αυξήθηκαν σημαντικά λόγω της έλλειψης νερού. Επιπλέον, αύξηση της έντασης αλλά και εμφάνιση νέων ισομορφών POD (ανιονικών και κατιονικών), SOD, EST και ACP καθώς και νέων πρωτεϊνικών ζωνών καταγράφηκαν στις μεταχειρίσεις της έλλειψης νερού και επανάρδευσης. Στις ρίζες του κλώνου ΝΟ1, υπό κανονικές συνθήκες άρδευσης, η προ μεταχείριση με ΡΒΖ προκάλεσε την εμφάνιση ισομορφών EST και ACP που καταγράφηκαν στα φυτά χωρίς ΡΒΖ μόνο μετά από έλλειψη νερού. Η πρόκληση έλλειψης νερού με χρήση μαννιτόλης, σε τρεις διαφορετικές συγκεντρώσεις, είχε ως αποτέλεσμα σημαντική μείωση του νωπού και ξηρού βάρους, της στοματικής αγωγιμότητας, της φωτοσύνθεσης και διαπνοής καθώς και της ειδικής ενζυμικής δραστικότητας των υπεροξειδασών στις ρίζες των φυτών δύο κλώνων πικροδάφνης (ΝΟ8 και ΝΟ9). Αντίθετα, αύξηση της ειδικής ενζυμικής δραστικότητας των υπεροξειδασών στα φύλλα και τους βλαστούς και της περιεκτικότητας των χλωροφυλλών καταγράφηκε στα φυτά και των δύο κλώνων. Κατά την ηλεκτροφόρηση των φυτικών δειγμάτων καταγράφηκε διαφοροποίηση των πρωτεϊνικών ζωνών και των ισομορφών των POD (ανιονικών και κατιονικών), APX, SOD, ACP, EST, DNασών και RNασών στους διάφορους ιστούς που μελετήθηκαν, διαφορετικών στους δύο κλώνους που αξιολογήθηκαν, καθώς και εμφάνιση νέων ισομορφών και νέων πρωτεϊνικών ζωνών λόγω της ωσμωτικής καταπόνησης, ιδιαίτερα στις ρίζες και των δύο κλώνων. Μία ημέρα μετά την άρση της καταπόνησης τα φυτά δεν ανέκαμψαν στην αρχική τους κατάσταση (μακροσκοπική παρατήρηση) ενώ ούτε οι ποσοτικές παράμετροι που αξιολογήθηκαν επανήλθαν στην πρότερή τους κατάσταση. Η προσθήκη σαλικυλικού οξέος (SA) σε φυτά δύο κλώνων πικροδάφνης (ΝΟ2 και ΝΟ3) ηλικίας 5 μηνών, που αναπτύσσονταν σε θρεπτικό διάλυμα υπό φυσιολογικές συνθήκες, προκάλεσε μείωση της φωτοσύνθεσης, της διαπνοής και της στοματικής αγωγιμότητας, της περιεκτικότητας των χλωροφυλλών και καροτινοειδών και αύξηση της ειδικής ενζυμικής δραστικότητας των υπεροξειδασών. Σε συνθήκες ωσμωτικής καταπόνησης που προκλήθηκε με χρήση πολυαιθύλενογλυκόλης (PEG), η προσθήκη SA ενέτεινε την απώλεια νωπού βάρους από τα φύλλα και την αύξηση της διαρροής των ηλεκτρολυτών. Αντίθετα, διατήρησε τον λόγο Α/Ε σε υψηλότερα επίπεδα και αύξησε την περιεκτικότητα των φύλλων σε χλωροφύλλες και καροτινοειδή. Διαφορετική επίδραση του SA στη φωτοσύνθεση, στην περιεκτικότητα σε προλίνη και πρωτεΐνες και στην ειδική ενζυμική δραστικότητα των υπεροξειδασών και των όξινων φωσφατασών καταγράφηκε στους δύο κλώνους πικροδάφνης. Μεταβολές της έντασης και εμφάνιση νέων ισομορφών POD (ανιονικών και κατιονικών), APX, SOD, EST και ACP καθώς και νέων πρωτεϊνικών ζωνών καταγράφηκαν στις μεταχειρίσεις της καταπόνησης και ανάνηψης, διαφορετικών μεταξύ των κλώνων και των φυτικών ιστών. Ορισμένες από τις νέες ισομορφές APOD, CPOD, APX και ACP που εμφανίστηκαν στα φυτά ως αποτέλεσμα της ωσμωτικής καταπόνησης με PEG, εμφανίστηκαν και στα φυτά που εφαρμόστηκε SA και διατηρούνταν σε κανονικές συνθήκες.