Μηχανισμοί απόκρισης φυτών στην τοξικότητα του βολφραμίου

Abstract

Tungsten (W) is a rare heavy metal, widely used in a range of industrial, military and household applications, due to its properties. Much work was conducted on W toxicity in animals and humans, less in ecosystems and much less in plants. In plants, W has been used as an inhibitor of the molybdoenzymes since it antagonizes molybdenum (Mo) for the Mo-cofactor (MoCo) of these enzymes. Awareness about the potential environmental toxicity of W is steadily growing. However, its specific subcellular effects remain more or less unknown. In the present study the effects of W on a range of morphological, cytological, subcellular and molecular parameters have been investigated, in combination with the possible antagonism of W for the pathway of Mo. W was applied in the form of tungstate (Na2WO4) at various concentrations in various plants and its effects were analyzed macroscopically, statistically, by molecular techniques etc. Seedlings of Pisum sativum were treated W, Mo or a combination of the two, had W-affected cortical microtubules that were low in number, short, not uniformly arranged and resistant to anti-microtubule drugs. The results indicate that cortical microtubules of plant cells are indirectly affected by W, most probably through a mechanism depending on the in vivo antagonism of W for the Mo-binding site of Cnx1 protein. This has been further established through experimentation on the cnx mutants of Nicotiana plumbaginifolia and Arabidopsis thaliana, and via an in vitro binding assay of W to Cnx1. In particular, null mutants of the Cnx1 protein appeared insensitive to W, especially regarding microtubules or Mo-enzymes. In order to examine the possible universality of this effect (disruption of cortical microtubules), treatments with tungstate were applied in various land plant taxa. W was applied on terrestrial plant representatives of monocots, dicots, gymnosperms, pterophytes and bryophytes, and the microtubules were investigated by tubulin immunofluorescence. However, the mechanism by which W affects the microtubule cytoskeleton remains elusive, and could be a side-effect of programmed cell death (PCD)-related processes, as it was found in Pisum sativum plants. W was also applied on Arabidopsis thaliana roots and several other effects, probably not related with the NO-depleting action of W, were revealed. In particular, W induced cells of the transition and elongation zones to differentiate prematurely, so that development of root hairs in W-treated seedlings took place closer to the root tip than in the controls. Results obtained from the present study indicate that, W is an emerging pollutant having not only the attributes of an inhibitor but also additional toxic effects to plant cells, some of which are similar with that of other heavy metals, including inhibition of seedling growth, reduction of root and shoot biomass, ultrastructural malformations of cell components, aberrations of the cell cycle, disruption of the cytoskeleton and deregulation of gene expression related with PCD.

Το βολφράμιο (W) είναι ένα σπάνιο βαρύ μέταλλο, που χρησιμοποιείται ευρέως σε μια σειρά βιομηχανικών, στρατιωτικών και οικιακών εφαρμογών. Οι σχετικές έρευνες έχουν επικεντρωθεί στην τοξικότητα του W στα ζώα και τους ανθρώπους, λιγότερο στα οικοσυστήματα και πολύ λιγότερο στα φυτά. Στα τελευταία, το W έχει χρησιμοποιηθεί πρώτιστα ως ανασταλτικός παράγοντας των μολυβδαινιο-ενζύμων δεδομένου ότι ανταγωνίζεται το μολυβδαίνιο (Mo) για τη σύνδεσή του στο συμπαράγοντα του μολυβδαινίου (MoCo) των ενζύμων αυτών. Στην παρούσα διατριβή διερευνήθηκε η επίδραση του W σε διάφορα επίπεδα, μορφολογικά, κυτταρικά, μοριακά κ.ά., σε σχέση με τον πιθανό ανταγωνισμό του W με το Mo. Το W εφαρμόστηκε υπό τη μορφή του βολφραμικού νατρίου σε διάφορες συγκεντρώσεις και χρόνους επίδρασης σε διάφορα φυτά. Σε αρτίβλαστα Pisum sativum πραγματοποιήθηκαν επιδράσεις W, Mo ή συνδυασμοί των δύο, και οι περιφερειακοί μικροσωληνίσκοι εξετάστηκαν με ανοσοσήμανση σωληνίνης και ηλεκτρονική μικροσκοπία. Οι επηρεασμένοι με W μικροσωληνίσκοι (W-μικροσωληνίσκοι) ήταν περιορισμένοι σε αριθμό, όχι ομοιόμορφα κατανεμημένοι και ανθεκτικοί σε αντι-μιτωτικά δηλητήρια. Η πρωτεΐνη Cnx1 μπορεί να μετέχει στη συγκεκριμένη απόκριση. Αυτό έχει περαιτέρω εδραιωθεί μετά από πειραματισμό σε μεταλλάγματα cnx των Nicotiana plumbaginifolia και Arabidopsis thaliana και μέσω μιας διαδικασίας in vitro δέσμευσης του W στη Cnx1. Ειδικότερα, μεταλλάγματα της πρωτεΐνης Cnx1 εμφανίστηκαν ανθεκτικά στη δράση του W (μικροσωληνίσκοι ή Mo-ένζυμα). Προκειμένου να εξεταστεί η ενδεχόμενη καθολικότητα αυτής της απόκρισης (διαταραχή των περιφερειακών μικροσωληνίσκων), πραγματοποιήθηκαν επιδράσεις W σε διάφορα φυτικά taxa, εκπροσώπους των χερσαίων φυτών, μονοκοτυλήδονων, δικοτυλήδονων, γυμνοσπέρμων, πτεριδοφύτων και βρυοφύτων. Ο μηχανισμός με τον οποίο το W έχει επιπτώσεις στον κυτταρικό σκελετό των μικροσωληνίσκων παραμένει αόριστος, εντούτοις θα μπορούσε η αποδιοργάνωση των μικροσωληνίσκων να είναι μια παρενέργεια της εκδήλωσης προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου (PCD) κυττάρων, όπως παρατηρήθηκε για το Pisum sativum. Το W εφαρμόστηκε επίσης στις ρίζες του φυτού Arabidopsis thaliana. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η δράση του W σε αυτές πιθανώς δεν σχετίζεται με την ιδιότητά του να λειτουργεί ως αναστολέας του ΝΟ. Tο W μείωσε την αύξηση της ρίζας επάγοντας τα κύτταρα της μεταβατικής ζώνης και της ζώνης επιμήκυνσης να διαφοροποιούνται πρόωρα, έτσι ώστε η ανάπτυξη των ριζικών τριχιδίων στα επηρεασμένα από W αρτίβλαστα να αρχίζει πιο κοντά στην άκρη της ρίζας από ό,τι στο μάρτυρα. Η παρούσα μελέτη δείχνει ότι, πέρα από την παρεμπόδιση των Mo-ενζύμων, το W είναι ένας νέος αναδυόμενος ρύπος που έχει όχι μόνο τις ιδιότητες ενός ανασταλτικού παράγοντα ενζύμων αλλά και τοξικά χαρακτηριστικά ενός μετάλλου, μερικά από τα οποία είναι παρόμοια με αυτά άλλων μετάλλων, συμπεριλαμβανόμενης της αναστολής αύξησης των αρτιβλάστων, δυσμορφίες των κυττάρων, αναστολή της μίτωσης, διαταραχή του κυτταρικού σκελετού και της έκφρασης των γονιδίων που σχετίζονται με τον PCD.