Ρόλος της δομής του μεταγραφικού παράγοντα HNF-4a στη γονιδιακή ρύθμιση των απολιποπρωτεϊνών

Abstract

Τhe present study aimed at investigating amino acid residues in the LBD region of nuclear receptor HNF-4α that are critical for its activity. For this purpose selected point mutations were introduced into residues of the LBD region that were previously shown to be important for interactions with the ligand in other nuclear receptor molecules. Receptor activity depends on the presence of a ligand in the majority of nuclear receptors examined. However, HNF-4α is not known to alter its activity in response to an exogenous ligand. It rather seems to act as a constitutive activator of transcription, independently of any added molecules. The rationale was to test whether amino acids homologous to those of other nuclear receptors would participate in formation of the ligand binding pocket, in case there was an endogenous ligand for HNF-4α. The results of this study confirm the functional importance of residues leucine (L)220, arginine (R)226, isoleucine (I)338 and, to a lesser extent, isoleucine (I)346 of the LBD region in HNF-4α mediated activation of transcription. Furthermore, they help discriminate between residues of the LBD region that are critical for HNF-4α activity in the absence or presence of coactivators. In this context, mutation of isoleucine (I)338 results in complete loss of function by the receptor, whereas the observed loss of activity in the case of mutant R226G can be reversed by the action of coactivators. While the present analysis was carried out the HNF-4α LBD was crystallized, offering a structural context for the functional observations emerging from this study, by revealing that HNF-4α is endogenously complexed with fatty acid molecules, which act as natural ligands for the receptor. However, fatty acids were not shown to have the same structural consequences for HNF-4α as exogenous ligands do for their cognate receptors, that is, they were not shown to stabilize the LBD in the energetically favorable, “closed” state. On the contrary, the HNF-4α LBD was found to contain endogenous fatty acids both in the “open” and “closed” conformations of the receptor, which led to the proposal that the key molecule stabilizing HNF-4α in its closed and active state may be the coactivator rather than the ligand, in contrast to what has been observed for other nuclear receptors. Our results act in support of this hypothesis, by showing that coactivators are capable of discriminating between different residues and “rescuing” inactive mutants, thereby controling the molecule’s transcriptional activity. In this way, the present study offers functional evidence and expands predictions of the crystallographic model concerning the functional significance of amino acid residues, which participate in the HNF-4α binding pocket of the endogenous ligand. The significance of broader HNF-4α regions, such as the D domain, for transcriptional activation by the receptor was also examined. The data emerging from the study confirm the significance of the D region for HNF-4α transcriptional activity and interaction with coactivators, in agreement to what was found for other nuclear receptors.

Η ανάλυση που διεξήχθη είχε ως πρώτο στόχο τη διερεύνηση των αμινοξέων, που είναι καθοριστικά για την ενεργότητα της LBD περιοχής του HNF-4α. Για το σκοπό αυτό εισήχθησαν επιλεγμένες σημειακές μεταλλάξεις σε αμινοξέα της LBD περιοχής, που είχε δειχθεί ότι είναι κρίσιμα για την αλληλεπίδραση με το συνδέτη σε άλλους πυρηνικούς υποδοχείς. Η ενεργότητα της LBD περιοχής εξαρτάται από την πρόσδεση του συνδέτη στην πλειοψηφία των πυρηνικών υποδοχέων, που έχουν εξεταστεί. Ωστόσο, ο HNF-4α δε διαφοροποιεί τη δραστηριότητά του ως απόκριση στην παρουσία εξωγενών μορίων-συνδετών. Αντίθετα, φαίνεται ότι δρα ως «ιδιοσυστατικός» ενεργοποιητής της μεταγραφής (constitutive activator) ανεξαρτήτως παρουσίας οποιουδήποτε εξωγενούς μορίου. Το σκεπτικό ήταν να διερευνηθεί κατά πόσο ομόλογα αμινοξέα με αυτά άλλων πυρηνικών υποδοχέων θα συμμετείχαν στην κοιλότητα πρόσδεσης του συνδέτη, σε περίπτωση που υπήρχε κάποιος ενδογενής συνδέτης για τον HNF-4α. Τα αποτελέσματα της παρούσας εργασίας αποδεικνύουν τη λειτουργική σημασία των αμινοξέων λευκίνη (L)220, αργινίνη (R)226, ισολευκίνη (I)338 και, σε μικρότερο βαθμό, ισολευκίνη (I)346 της LBD περιοχής για την ενεργοποίηση της μεταγραφής από τον HNF-4α. Επιπλέον, βοηθούν στη διάκριση αμινοξέων, που είναι καθοριστικά για την ενεργότητα της LBD περιοχής κάτω από διαφορετικές συνθήκες. Έτσι, μετάλλαξη της ισολευκίνης (I)338 οδηγεί σε ανεπανόρθωτη απώλεια της ενεργότητας του μεταγραφικού παράγοντα, ενώ η απώλεια ενεργότητας που παρατηρείται στην περίπτωση της μετάλλαξης R226G είναι δυνατόν να αντιστραφεί παρουσία συνενεργοποιητών. Η κρυστάλλωση της LBD περιοχής του HNF-4α κατά τη διάρκεια διεξαγωγής της μελέτης πρόσφερε το δομικό πλαίσιο για την ένταξη των λειτουργικών παρατηρήσεων, που προέκυψαν από τη μελέτη. Ειδικότερα, φανέρωσε ότι ο HNF-4α είναι ενδογενώς συνδεδεμένος με μόρια λιπαρών οξέων, τα οποία διαδραματίζουν το ρόλο φυσικών του συνδετών. Ωστόσο, τα μόρια αυτά δεν έχουν για τον HNF-4α τη δομική σημασία, που έχουν οι εξωγενείς συνδέτες για άλλους πυρηνικούς υποδοχείς, δηλαδή τη σταθεροποίηση της LBD περιοχής στην ενεργειακά ευνοϊκότερη, «κλειστή» διαμόρφωση. Αντίθετα, στον HNF-4α η LBD περιοχή περιέχει δεσμευμένα λιπαρά οξέα ανεξαρτήτως του αν βρίσκεται στην «ανοιχτή» ή «κλειστή» διαμόρφωση, κάτι που οδήγησε στη διατύπωση της πρότασης ότι το ρόλο σταθεροποιητή στην περίπτωση του HNF-4α μπορεί να παίζουν μόρια διαφορετικά από τους συνδέτες, όπως οι συνενεργοποιητές. Τα αποτελέσματά μας έρχονται να ενισχύσουν την υπόθεση της σπουδαιότητας των συνενεργοποιητών στη ρύθμιση της δράσης του HNF-4α, καθώς δείχνουν ότι τα συγκεκριμένα μόρια είναι σε θέση να διακρίνουν μεταξύ διαφορετικών αμινοξέων και να «διασώζουν» λειτουργικά ανενεργές μεταλλάξεις, έχοντας τον «τελικό λόγο» στη δραστικότητα του μεταγραφικού παράγοντα. Κατ’ αυτόν τον τρόπο η παρούσα μελέτη συμπληρώνει με λειτουργικά στοιχεία και επεκτείνει τις προβλέψεις του κρυσταλλογραφικού μοντέλου σχετικά με τη λειτουργική σημασία αμινοξέων, που συμμετέχουν στην κοιλότητα πρόσδεσης του ενδογενούς συνδέτη του HNF-4α. Ο δεύτερος στόχος της εργασίας ήταν η διερεύνηση της σημασίας ευρύτερων περιοχών του LBD του HNF-4α, όπως η περιοχή D, για τη μεταγραφική δραστηριότητα του υποδοχέα και την ενίσχυση από τους συνενεργοποιητές. Η παρούσα μελέτη επιβεβαίωσε τη σημασία της D περιοχής για την ενεργότητα του HNF-4α και την αλληλεπίδρασή του με τους συνενεργοποιητές, σε συμφωνία με ό,τι έχει δειχθεί ότι συμβαίνει και σε άλλους πυρηνικούς υποδοχείς.