Βελτίωση σύνθεσης πεπτιδίων και οργανικών μορίων με χρήση ευαίσθητων σε οξέα πολυμερών υποστρωμάτων

Abstract

The synthesis of peptides and organic molecules in Trt-type acid-labile solid polymers was studied in this thesis. Particularly, we focused initially on the synthesis of salmon I Calcitonin, a peptide consisting of 32 aminoacids. Salmon I Calcitonin was synthesised using both phase-change and conventional solid-phase fragment condensation (SPFC) approaches, utilising the Rink amide linker (Fmoc-amido-2,4-dimethoxybenzyl-4-phenoxyacetic acid) combined with 2-Chlorotrityl resin and the Fmoc/tBu(Trt)-based protection scheme. Phase-change synthesis, performed by the selective detachment of the fully protected C-terminal 22-mer peptide-linker from the resin and subsequent condensation in solution with the N-terminal 1-10 fragment, gave a product of slightly less purity (85 vs. 92%) than the corresponding synthesis on the solid phase. In both cases salmon I Calcitonin was easily obtained in high purity. Subsequently, we examined the effective purification of protected peptide fragments of medium polarity of human prothymosin. The procedure included glass columns packed with RP-8 and RP-18 materials that were eluted with mixtures of acetonitrile and water under isocratic conditions. After applying medium pressure for elution, we obtained pure peptides (in >99% purity) and the purification yield was ranging between 53-86%. During the solid phase fragment condensation we studied the racemization using various reagents and under various conditions in the case of human prothymosin as the example. Minimal racemization was observed with the use of either DCC or DIC as dehydrating reagents, HOBt and DhBt as acidic additives and DMSO as the reaction solvent. Finally, the attachment and cleavage of diamines from resins of the Trt-type was studied. Depending on the type of diamine, different cross-linking percentage occurs. It was found that cross-linking of the resin increases with increasing length of the diamine and in some cases cyclic diamines give low cross-linking percentance as well, thus resulting to higher loading and higher reaction yield.

Στη διατριβή αυτή έγινε μελέτη της σύνθεσης πεπτιδίων και οργανικών μορίων επί Trt-τύπου πολυμερών υποστρωμάτων ευαίσθητων σε οξέα. Συγκεκριμένα, μελετήθηκε αρχικά η σύνθεση της καλσιτονίνης του σολομού, μιας πρωτεΐνης που αποτελείται από 32 αμινοξέα. Η σύνθεσή της πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας τόσο τη μέθοδο συμπύκνωσης προστατευμένων πεπτιδικών τμημάτων σε στερεά φάση, όσο και τη μέθοδο σύνθεσης με εναλλαγή φάσης (με συνδυασμό δηλαδή της σύνθεσης σε διάλυμα και της σύνθεσης σε στερεά φάση). Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκε ο Rink amide linker διασυνδεδεμένος στην εξαιρετικά ευαίσθητη σε οξέα 2-Chlorotrityl chloride resin, και το Fmoc/tBu προστα-τευτικό σχήμα. Η σύνθεση με εναλλαγή φάσης πραγματοποιήθηκε με εκλεκτική αποσύνδεση του C-τελικού 22-μερές πεπτιδίου-linker από τη ρητίνη και στη συνέχεια συμπύκνωσή του σε διάλυμα με το Ν-τελικό δεκαπεπτίδιο. Η μέθοδος αυτή απέδωσε προϊόν ελάχιστα χαμηλότερης καθαρότητας (85 έναντι 92%) από την αντίστοιχη σύνθεση σε στερεά φάση. Ακολούθως μελετήθηκε ο καθαρισμός προστατευμένων πεπτιδικών τμημάτων μέτριας πολικότητας της ανθρώπινης προθυμοσίνης, με χρήση υγρής χρωματο-γραφίας μέτριας πίεσης. Χρησιμοποιήθηκαν υάλινες στήλες με υλικό πλήρωσης RP-8 και RP-18, σωματίδια διαμέτρου 40-63 μm, και ισοκρατικές συνθήκες έκλουσης ακετονιτριλίου και νερού. Εξαιτίας του σχετικά μεγάλου μεγέθους των σωματιδίων του υλικού, ασκήθηκε μέτρια πίεση και προέκυψαν προϊόντα υψηλής καθαρότητας (>99%), και με εύρος απόδοσης 53-86%. Κατά τη σύνθεση της ανθρώπινης προθυμοσίνης με συμπύκνωση πεπτιδικών τμημάτων σε στερεά φάση, μελετήθηκε η δημιουργία ρακεμικού προϊόντος. Η χρήση διαφορετικών αντιδραστηρίων και συνθηκών σύζευξης απέδωσε διαφορετικό ποσοστό ρακεμικού προϊόντος. Το μικρότερο ποσοστό ρακεμικού προϊόντος προέκυψε με τη χρήση του DCC ή του DIC ως αντιδραστήρια ενεργοποίησης, του HOBt ή DhBt ως όξινα πρόσθετα και του DMSO ως διαλύτη της αντίδρασης σύζευξης. Τέλος μελετήθηκε η σύζευξη διαμινών στις CLTR, TRTR, MMTR και MTTR, καθώς και οι συνθήκες αποδέσμευσής τους από αυτές. Ανάλογα με το είδος της διαμίνης παρατηρήθηκε και διαφορετικό ποσοστό διασύνδεσής τους από τις δύο αμινομάδες (cross-linking), τόσο μεταξύ δύο αλυσίδων πολυστυρολίου, όσο και μέσα στην ίδια αλυσίδα πολυμερούς. Κατά τη συγκεκριμένη μελέτη, προέκυψε ότι το ποσοστό του cross-linking εξαρτάται άμεσα από το μήκος και τη δομή της διαμίνης. Γραμμικές διαμίνες μικρότερου μήκους και σε ορισμένες περιπτώσεις κυκλικές διαμίνες, δίνουν μικρότερο ποσοστό cross-linking και άρα μεγαλύτερο βαθμό υποκατάστασης και συνεπώς μεγαλύτερη απόδοση σύνθεσης.