Μεθοδολογία σύνθεσης πρωτεϊνών: σύνθεση ιρουδίνης

Abstract

The number of peptides and small proteins that is used as pharmaceutical products has increased in the last years. These peptides were produced with techniques of genetic engineering, but now the development of peptide chemistry made their chemical synthesis more attractive. In the present thesis we studied the new possibilities of peptide chemistry on protein synthesis. We used as model for our studies the synthesis of Hirudin, which is a protein with important pharmaceutical interest. Hirudin was synthesized independently by two different methods; the fragment condensation method, which is the most common method for the synthesis of peptides in the last few years and the method of native chemical ligation, which is a new and very promising method. The sequence of Hirudin was divided in 8 protected fragments, for the synthesis by fragment condensation method. Protected fragments were synthesized with SPPS using Fmoc/tBu chemistry. The whole peptide sequence was accomplished after the condensations of protected peptides, which were performed with DIC/HOBt. Free protein was isolated after treatment with TFA/EDT/H2O (90:5:5) and then it was converted to its oxidized form. For the synthesis of Hirudin by native chemical ligation, the sequence was divided in fragments 1-27 and 28-65. Fragment 1-27 was the C-thioester peptide and 28-65 the N-Cys peptide. The two fragments were accomplished from condensations of the smaller peptide fragments. The peptide fragment 1-27 was turned to thioester using a new method. According to this method the peptide was synthesized by Fmoc chemistry, attached to a Mmt resin and its free carboxyl group was turned to thiester. This method is better than all the others that have been used until now. Orthogonal ligation between the two fragments gave Hirudin.

Τα τελευταία χρόνια αυξάνει όλο και περισσότερο ο αριθμός των πεπτιδίων και των μικρών πρωτεϊνών που χρησιμοποιούνται ως φαρμακευτικά προϊόντα. Αρχικά αυτά τα πεπτίδια παράγονταν με τις τεχνικές της γενετικής μηχανικής, όμως η τάση αυτή τείνει να αλλάξει καθώς η πρόοδος που έχει επιτευχθεί στην πεπτιδική σύνθεση κάνει ελκυστικότερη τη χημική τους σύνθεση. Στην παρούσα εργασία μελετήθηκαν οι νέες δυνατότητες της πεπτιδικής χημείας πάνω στη σύνθεση πρωτεϊνών. Ως μοντέλο χρησιμοποιήθηκε η σύνθεση της πρωτεΐνης Ιρουδίνης, μιας πρωτεΐνης με σημαντικό φαρμακευτικό ενδιαφέρον. Η Ιρουδίνη συντέθηκε ανεξάρτητα με δύο διαφορετικές μεθόδους: τη μέθοδο τμηματικής συμπύκνωσης, που είναι η μέθοδος επιλογής τα τελευταία χρόνια για τη σύνθεση μεγάλων πεπτιδίων και τη μέθοδο ορθογωνικής σύνδεσης μέσω θειοεστέρα, μία κανούργια μέθοδο που δίνει νέες προοπτικές στην πεπτιδική σύνθεση. Για τη σύνθεση της Ιρουδίνης με τη μέθοδο της τμηματικής συμπύκνωσης η αλληλουχία χωρίστηκε σε 8 πεπτιδικά τμήματα. Τα προστατευμένα πεπτιδικά τμήματα συντέθηκαν με τη SPPS χρησιμοποιώντας Fmoc/tBu χημεία. Ολόκληρη η πεπτιδική αλληλουχία προέκυψε από τις συμπυκνώσεις των 8 πεπτιδίων, οι οποίες πραγματοποιήθηκαν με DIC/HOBt. Η ελεύθερη πρωτεΐνη απομονώθηκε ύστερα από κατεργασία με μίγμα TFA/EDT/H2O (90:5:5) και στη συνέχεια μετατράπηκε στην οξειδωμένη της μορφή. Στη σύνθεση με τη μέθοδο ορθογωνικής σύνδεσης μέσω θειοεστέρα η αλληλουχία χωρίστηκε στα τμήματα 1-27 και 28-65. Το τμήμα 1-27 ήταν το C-θειοεστερικό πεπτίδιο και το 28-65 το N-Cys πεπτίδιο. Τα δύο πεπτιδικά τμήματα προήλθαν από τις συμπυκνώσεις των μικρότερων πεπτιδικών τμημάτων. Το πεπτιδικό τμήμα 1-27 μετατράπηκε σε θειοεστέρα με την εφαρμογή μιας νέας μεθόδου η οποία βασίζεται στη σύνθεση του πεπτιδίου με Fmoc χημεία, τη διασύνδεσή του πλευρικά σε μία Mmt ρητίνη και την μετατροπή της ελεύθερης καρβοξυλομάδας του σε θειοεστερική. Η μέθοδος πλεονεκτεί έναντι των μέχρι σήμερα χρησιμοποιούμενων. Η ορθογωνική σύνδεση ανάμεσα στα 2 τμήματα έδωσε την Ιρουδίνη, με μικρή όμως απόδοση.