Η επίδραση της ντοπαμίνης και των οιστρογόνων στο επίπεδο της mRNA προλακτίνης σε διαφορετικούς προλακτινικούς κυτταρικούς πληθυσμούς

Abstract

We have examined the effect of the dopamine (DA) and oestradiol on PRL gene expression using quantitative in situ hybridization histochemistry in different pituitary cell (sub) populations separated according to their density on a discontinuous Percoli gradient. Administration of DA resulted in a drastic reduction in hybridization of 35S - labeled DNA probe complementary to PRL messenger RNA in total pituitary cell and in lactotrophs with low density. In contrast this DA - induced effect was not significant in PRL cells with high density. The combined use of Percoli gradient and quantitative in situ hybridization is a valuable and sensitive method for examining PRL cell response to a given stimulation. PRL cells with high and low density clearly behave differently in response to DA. When cells were incubated in vitro in the presence of oestradiol (IO-8 M) in an oestradiol-free culture medium for a period of 4, 24, 48 and 72 h, a rise of prolactin mRNA copies was present from 24 h on, only in the high density prolactin cells and lactotrophs of total cell suspension. In contrast, prolactin mRNA copies of lactotrophs of low density did not change upon treatment with oestradiol. Pharmacological treatment with oestradiol of random cycling female rats in vivo for a period of 14 days (oestradiol 50 pg s.c./dav) increased the total number of prolactin gene expressing cells and more lactotrophs were recovered a high density after Percoli gradient centrifugation. These results suggest a preferential stimulatory effect of oestradiol on prolactin gene transcription on subpopulation of lactotrophs. Changes observed in prolactin cell layers after oestradiol treatment in vivo, may represent a preferential effect in situ on a particular mammotroph cell subpopulation.

Για να αναλυθεί έως ποιο βαθμό η λειτουργική διαφοροποίηση μεταξύ των κυττάρων συμβάλλει στη φυσιολογία της αδενοϋπόφυσης, απαιτείται μια καλή κατανόηση της φυσιολογίας των ξεχωριστών υποφυσιακών κυττάρων. Η ετερογένεια του συνολικού κυτταρικού πληθυσμού, πράγματι, αποτελεί ένα σοβαρό μειονέκτημα για τη μελέτη της απάντησης ενός ενδοκρινικού κυττάρου σε διαφορετικούς παράγοντες (πεπτίδια, νευροπεπτίδια, αναπτυξιακοί παράγοντες κλπ). Έτσι, εμπλουτίσαμε τα κύτταρα που εκκρίνουν προλακτίνη και αυξητική ορμόνη, χρησιμοποιώντας φυγοκέντρηση διαβάθμισης Percoli. Σε μια πρώτη μελέτη ελέγξαμε την κυτταρική βιωσιμότητα και χρησιμοποιώντας μία συνεχή διαβάθμιση, επιλέξαμε διακυμάνσεις πυκνότητας για τον περαιτέρω καθαρισμό των γαλακτοτρόπων και σωματοτρόπων κυττάρων. Η χρησιμοποίηση ασυνεχών διαβαθμίσεων προσφέρει το πλεονέκτημα του διαχωρισμού σχεδόν καθαρών γαλακτοτρόπων και σωματοτρόπων κυτταρικών κλασμάτων. Το πειραματικό μας μοντέλο διαθέτει αρκετά πλεονεκτήματα έναντι προηγούμενων in vitro μοντέλων, το κυριότερο από τα οποία είναι η χρησιμοποίηση φυσιολογικών και όχι νεοπλασματικών κυττάρων. Τα νεοπλασματικά κύτταρα έχει αποδειχθεί ότι υφίστανται λειτουργικές μεταβολές σε απάντηση στους διαφορετικούς εκλυτικούς και ανασταλτικούς παράγοντες (Dannies et al., 1977). Συγκρινόμενη με άλλες μεθόδους, που έχουν περιγράφει για τον κυτταρικό διαχωρισμό, η μέθοδος είναι απλή και δεν απαιτεί περίπλοκο εξοπλισμό. Το Percoli εμφανίζει ιδιότητες, οι οποίες το καθιστούν ως ένα ιδανικό υλικό για το διαχωρισμό των ζώντων κυττάρων. Ο διαχωρισμός μπορεί να πραγματοποιηθεί σε θερμοκρασία δωματίου και ο χρόνος φυγοκέντρησης είναι μικρός, επιτυγχάνοντας με αυτό τον τρόπο μία ελάχιστη απώλεια της κυτταρικής βιωσιμότητας. Η καθαρότητα των γαλακτοτρόπων κυττάρων ανέρχεται στο 85% και η ανάκτηση των γαλακτοτρόπων κυττάρων στο τέλος του διαχωρισμού, είναι 81% του συνολικού αριθμού των γαλακτοτρόπων κυττάρων, πριν από το διαχωρισμό. Άλλες τεχνικές δεν μπόρεσαν να επιτύχουν να φθάσουν αυτή την ανάκτηση, τη βιωσιμότητα και την καθαρότητα των γαλακτοτρόπων κυττάρων. Οι ιδιότητες επιφάνειας (διαχωρισμός συγγένειας με τη χρήση της σύνδεσης στην TRH ή τη διάκριση των FACS με τη χρήση αντί-PRL φθοριζόντων επισημασμένων αντισωμάτων), χρησιμοποιούνται για να διαχωρίσουν υψηλά εμπλουτισμένα γαλακτοτρόπα κύτταρα (μέχρι 90%). Ωστόσο, αυτές οι τεχνικές κυτταρικού διαχωρισμού οδηγούν σε μια σημαντική απώλεια των αρχικών γαλακτοτρόπων κυττάρων που είναι παρόντα στα παρασκευάσματα συνολικών, μη διαχωρισμένων, κυττάρων (μόνο 20% των αρχικών κυττάρων). Τα κύτταρα που ανακτώνται δεν είναι αντιπροσωπευτικά του συνολικού γαλακτοτροπικού κυτταρικού πληθυσμού. Με τους διαχωρισμούς, που σχετίζονται με τις διαφορές στο μέγεθος (φυγοκεντρικός αποχωρισμός και καθίζηση μονάδας βαρύτητας), η ανάκτηση των γαλακτοτρόπων κυττάρων είναι καλή (70-90%), αλλά τα γαλακτοτρόπα κύτταρα διασκορπίζονται σε πολλά κλάσματα, γεγονός που οδηγεί σε έναν μέγιστο εμπλουτισμό του 65% με καθίζηση μονάδας βαρύτητας. Παρόλο που η τελευταία μέθοδος παρέχει ένα κατάλληλο μοντέλο για τον εμπλουτισμό των γοναδοτρόπων κυττάρων (Denef and Andries, 1983), τα μεγέθη των γαλακτοτρόπων και σωματοτρόπων κυττάρων συμπίπτουν, εν μέρει, γεγονός που οδηγεί σε ανεπαρκή διαχωρισμό των δύο κυτταρικών τύπων. Οι διαφορές μεγέθους των κυττάρων έχουν προηγουμένως σχετισθεί με τις διαφορές στη λειτουργία. Ένας τέτοιος συσχετισμός δεν επιτυγχάνεται ανάμεσα σε κυτταρικούς τύπους διαφορετικών πυκνοτήτων. Με αυτή τη μέθοδο διαχωρισμού, τα γαλακτοτρόπα κύτταρα ανακτώνται σε περισσότερες από δύο διακυμάνσεις πυκνότητας. Τα επίπεδα της ενδοκυτταρικής προλακτίνης ανά γαλακτοτρόπο κύτταρο είναι σημαντικά υψηλότερα στη στιβάδα υψηλής πυκνότητας (στιβάδα 2) (οι τιμές για το περιεχόμενο ανά 105 κύτταρα και το % ποσοστό κυττάρων που περιέχουν PRL σε αυτό το κλάσμα), οδηγεί σε μία μέση τιμή των 26 pg/υποφυσιακό γαλακτοτρόπο κύτταρο συγκρινόμενο με 16 pg/υποφυσιακό γαλακτοτρόπο κύτταρο σε μη διαχωρισμένα κύτταρα και 15,2 pg/γαλακτοτρόπο κύτταρο σε εμπλουτισμένα γαλακτοτρόπα κύτταρα χαμηλής πυκνότητας (στιβάδα 1). Μετά από κυτταρική καλλιέργεια σύντομης διάρκειας, οι διαφορές αυτές παραμένουν, κυτταρική προλακρίνη ανά γαλακτοτρόπο κύτταρο ελαττώνεται σε χαμηλό PRL κυτταρικό κλάσμα όταν συγκριθεί με τα συνολικά γαλακτοτρόπα κύτταρα και τα γαλακτοτρόπα κύτταρα υψηλής πυκνότητας (10,4 pg/ γαλακτοτρόπο κύτταρο στη στιβάδα 1,21 pg/γαλακτοτρόπο κύτταρο στα συνολικά κύτταρα, 20 pg/γαλακτοτρόπο κύτταρο στη στιβάδα 2). Η μελέτη αυτή αποδεικνύει, επίσης, ότι ο ποσοτικός in situ υβριδισμός συνδυαζόμενος με τη μέθοδο RIA, για την εκκρινόμενη και αποθηκευόμενη ορμόνη στις διαφορετικές κυτταρικές στιβάδες, παρέχει μεγαλύτερη πληροφόρηση, όσον αφορά τη φυσιολογική κατάσταση του γαλακτοτρόπου κυττάρου. Το PRL περιεχόμενο από μόνο του, δεν αποτελεί καλό «καθρέφτη» της ενδοκρινικής δραστηριότητας του κυττάρου, της αντικατάστασης και έκκρισης του πεπτιδίου που ευρίσκεται εκτός ελέγχου. Η συσσώρευση του ειδικού mRNA προηγείται γενικά μίας αύξησης του συνθετικού ρυθμού της αντίστοιχης ορμόνης (Seoh et al., 1979). Συνεπώς, ο ISH μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την εκτίμηση της σχετικής συνθετικής δραστηριότητας των γαλακτοτρόπων κυττάρων στις διαφορετικές κυτταρικές στιβάδες. Αποδεικνύουμε εδώ ότι τα γαλακτοτρόπα κύτταρα υψηλής πυκνότητας εμφανίζουν μία κατασταλτική δραστηριότητα, ως αποτέλεσμα της χαμηλής συνθετικής και εκκριτικής λειτουργίας, και η PRL ανοσοδραστικότητα των κυττάρων αυτών είναι υψηλή σύμφωνα προς το υψηλό ενδοκυτταρικό PRL περιεχόμενο, υποδηλώνοντας την αποθήκευση του πεπτιδίου. Αντίθετα, τα γαλακτοτρόπα κύτταρα χαμηλής πυκνότητας είναι πάρα πολύ ενεργά και περιέχουν υψηλά επίπεδα PRL mRNA (ανιχνεύσιμο με αυτοραδιογραφία). Η έκκριση της προλακτίνης αυξάνεται, ενώ η ανοσοδραστικότητα καθώς και το ενδοκυτταρικό περιεχόμενο σε προλακτίνη, αυτών των γαλακτοτρόπων κυττάρων είναι χαμηλά. Σε όλες τις ομάδες των γαλακτοτρόπων κυττάρων που μελετήθηκαν, ο συνδυασμός του ISH (PRL mRNA περιεχόμενο) με την ανοσοκυτταροχημεία (περιεχόμενο σε PRL) παρέχει μέγιστη πληροφόρηση για τη φυσιολογική κατάσταση του γαλακτοτρόπου κυττάρου. Στη συνέχεια ερευνήσαμε την επίδραση διαφορετικών διεγερτών και αναστολέων στην έκκριση της προλακτίνης. Ελέγχθηκε η επίδραση της ντοπαμίνης και των οιστρογόνων στο συνθετικό και εκκριτικό ρυθμό αυτών των δύο προλακτινικών κλασμάτων. Κατόπιν χρησιμοποιήσαμε τη μέθοδο του ISH για την εκτίμηση του αριθμού των κυττάρων που εκφράζουν το PRL mRNA και για να ποσοτικοποιήσουμε πιθανές αλλαγές στο επίπεδο του PRL mRNA σε ανεξάρτητα κύτταρα. Επιπλέον, η τεχνική RIA χρησιμοποιήθηκε για τη μέτρηση της εκκρινομένης προλακτίνης. Αποδεικνύουμε ότι τα γαλακτοτρόπα κύτταρα από τη στιβάδα 2 είναι λιγότερο ευαίσθητα στην αναστολή από την ντοπαμίνη, υπό όρους συσσώρευσης του mRNA, και διεγείρονται, κατά προτίμηση από τα οιστρογόνα. Η ντοπαμίνη αναστέλλει την απελευθέρωση της προλακτίνης (RIA) και στους δύο προλακτινικούς υποπληθυσμούς και τα οιστρογόνα δεν επηρεάζουν την εκκριτική τους δραστηριότητα πάνω από μία περίοδο 72 ωρών, δείχνοντας ότι η συσσώρευση του mRNA δεν σχετίζεται απαραίτητα με την έκκριση ορμόνης. Ο ISH προσφέρει το πλεονέκτημα της ανάλυσης των αλλαγών στη συσσώρευση του mRNA, σε ένα μοναδικό κύτταρο, ενώ η τεχνική σημειακού - γραφήματος συνοψίζει μόνο τις μεταβολές στα επίπεδα του mRNA εντός ενός ιστού ή ενός διαχωρισμένου κυτταρικού πληθυσμού (Dumah and Palmiter, 1985). Τα δεδομένα που παρουσιάζονται εδώ, παρέχουν περαιτέρω απόδειξη των διαφορών στη ρύθμιση της μεταγραφής σε διαφορετικά γαλακτοτρόπα κύτταρα, που διαχωρίστηκαν σύμφωνα με τις διαφορές τους στη πυκνότητα. Η λειτουργική αυτή απόκλιση, που παρατηρούμε, μπορεί να είναι σχετική με τα ορμονικά επίπεδα του προσθίου λοβού της υπόφυσης in vivo. Οι Bookfor and Frawley έδειξαν ότι τα γαλακτοτρόπα κύτταρα που προέκυψαν από διαφορετικές περιοχές του προσθίου λοβού της υπόφυσης εμφανίζουν διαφορετικές απαντήσεις στις DA και TRH χρησιμοποιώντας τη μέθοδο RHPA για τον ποσοτικό προσδιορισμό της ορμονικής απελευθέρωσης στο κυτταρικό επίπεδο (Bookfor and Frawley, 1987). Οι διαφορές στην εισαγωγή του υποθαλάμου μπορεί να ευθύνονται γι’ αυτές τις παρατηρήσεις (Bookfor and Frawley, 1987, Reymond et al., 1983). H ετερογένεια στη βασική συνθετική ικανότητα και στο PRL περιεχόμενο που παρατηρούμε αμέσως μετά το διαχωρισμό, είναι σύμφωνη με τη λειτουργική απόκλιση που παρατηρείται in vivo. Οι σχετικές με την κυτταρική πυκνότητα διαφορές στην κατανομή συχνότητας της απελευθέρωσης του mRNA και της προλακτίνης παραμένουν υπαρκτές σε βραχυπρόθεσμες καλλιέργειες. Οι Hofland et al., απέδειξαν ότι τα κύτταρα πρέπει να καλλιεργηθούν για μια τουλάχιστον εβδομάδα ώστε να παρουσιάσουν το ίδιο εκκριτικό πρότυπο (Hofland et al., 1990). Τα μη διαχωρισμένα γαλακτοτρόπα κύτταρα (συνολική κυτταρική στιβάδα) μειώνουν την αυτόματη έκκρισή τους και το ρυθμό συνθετικής τους δραστηριότητας. Οι παρακρινικές αλληλεπιδράσεις στη συνολική κυτταρική στιβάδα, που προκαλούνται από in vitro κυτταρικές συνθήκες, μπορεί να διαδραματίζουν κάποιο ρόλο στη συμπεριφορά του γαλακτοτρόπου κυττάρου. Συμπερασματικά, προτείνουμε ότι η λειτουργική ετερογένεια, η οποία περιγράφεται ανάμεσα στους κυτταρικούς τύπους του προσθίου λοβού της υπόφυσης, μπορεί να επηρεάσει σημαντικά τον καθορισμό των ορμονικών επιπέδων και ορμονικών απαντήσεων στους εκκρινοαγωγούς, in vitro και in vivo. Δεν είναι ακόμη σαφές πώς προκαλούνται αυτές οι διαφορές. Περαιτέρω χειρισμοί των υποφυσιακών κυττάρων, in vitro, θα απαιτηθούν για τη διερεύνηση των επιδράσεων άλλων υποφυσιακών κυτταρικών τύπων (συν - καλλιέργεια διαφορετικών κυτταρικών τύπων) και περιφερικών και/ή υποθαλαμικών παραγόντων, στη ρύθμιση της λειτουργίας του γαλακτοτρόπου κυττάρου και στον έλεγχο της έκφρασης του ειδικού για την PRL γονιδίου.