Οργάνωση και ρύθμιση της έκφρασης των πρώιμων γονιδίων του χορίου του μεταξοσκώληκα Bombyx mori

Abstract

Insect choriogenesis is a suitable system for studying developmentally regulated genes, as well as the molecular mechanisms affecting their evolution. In the silkworm Bombyx mori chorion genes are expressed in a highly tissue-, spatial- and temporal specific manner. According to their developmental specificity of expression, they are characterised as early, middle, or late. The chorion gene superfamily contains two branches, α and β, each of which encompasses several families. Typically, α and β genes of the same developmental specificity, are organised in divergently transcribed gene pairs, which share a common 5' flanking promoter region. All chorion genes are organised in two genetic loci of chromosome 2: Ch1-2 contains all late and most of the middle genes, while Ch3 contains all early genes and the remaining middle genes. As an exception, three unpaired copies of an early β-gene, named 6F6, are dispersed in the late chorion locus.The aim of the present thesis is the structural and functional analysis of the 6F6genes, in order to answer questions related with unusual features, such as: the fact that they are unpaired, and dispersed among late genes, while maintaining their early developmental specificity of expression. This represents the first attempt to study early chorion gene regulation in B. mori. (a) Structural analysis The complete nucleotide sequence of chromosomal subclones B9-E4 and B17-E2.4 containing the 6F6.2 and 6F6.3 genes, respectively, was determined. The coding and non coding regions of the 6F6 genes where identified by sequence similarities to the already known 6F6.1 gene and the cDNA clone m6F6. Comprehensive sequence analysis of all three genes revealed that: they have all the characteristics of transcriptionally active genes, are unpaired, code for early β-type chorion proteins, have introns with inserts and have retained extensive homologies by gene-conversion like events, unlike other known early β-type genes. Based on certain features of 6F6genes, such as their relative orientation in chorion locus Ch1-2, and sequence analysis of their adjacent regions, it was possible to propose a parsimonious evolutionary pathway explaining why these genes are unpaired and how they were dispersed among late genes. Moreover, two new repetitive sequences, named IR and HOPE, were found in the introns of 6F6.2 and 6F6.3 gene, respectively. IR is a 248 bp long segment, flanked by two 100 bp long imperfect inverted terminal repeats, whereas HOPE has the characteristics of a non LTR retrotransposon which is inserted in a Bm1 element contained in the intron of 6F6.3 gene. The copy numbers of these elements in B. mori were estimated at 5 X 103 for IR and 2 X 104 for HOPE, per haploid genome.(b) Functional analysisThe putative promoter regions of 6F6 genes extend at a distance ofapproximately 160 bp from the cap site. Comparisons with the respective sequences of other chorion genes, showed that they share no sequence similarities with the 5' flanking regions of early genes, whereas it is possible to align the 5' flanking regions of 6F6 genes with those of middle and late genes. Taking into consideration that these similarities could be the result of gene conversion events, which occur quite frequently in the late chorion locus, there was an effort to identify specific cis elements responsible for the early specificity of 6F6 gene expression.The 5' flanking region of the 6F6.2 gene (up to -138 bp, distance from cap site) was isolated and tested in ex vivo experiments for its ability to promote specific expression of a reporter gene in B. mori follicular cells. Using the biolistic method on isolated ovarioles containing all choriogenic stages, it was shown that this region is sufficient for the expression of the reporter gene in the epithelium of follicles of early developmental specificity. In vitro DNA-protein interaction experiments, using a smaller fragment of the 6F6.2 5' flanking region, indicated that sequence 5'-TAGTTGTTTGGCAAC-3' (at position -43 ως -56, region B) could interact with a proteinfrom early nuclear follicular extracts. This protein was named pX2 and its molecular weight was estimated approximately 70 KD. Interestingly, pX2 can also interact in early stages with late promoters and more specifically with the DNA binding region of a latespecific factor, named BCFII. Given that region B and the DNA binding region of BCFII are very similar and, moreover, that the two sequences compete with each other in bandshift experiments, one might infer that pX2 is BCFII. This hypothesis is not in agreement with previous data from other researchers, which attribute to the putative BCFII factor different features than pX2. The possibility of a factor which exhibits different specificities during choriogenesis, due to the existence of different isoforms orto post-translational modifications, cannot be excluded. Attempts to isolate a cDNAclone for pX2 from a choriogenic cDNA expression library, in order to characterise thisfactor, were not successfull. Preliminary results show that pX2 can interact in the early stages not only withthe other 6F6 promoters but also with promoter regions of chorion genes from different developmental stages. Interestingly, sequences very similar to region B of 6F6.2 promoter, which interacts with pX2, exist at least once in almost all chorion genepromoters. The above observations indicate that pX2 might be a general factor of choriogenesis and that temporal specificity of each gene is determined by synergistic interactions with other more specific factors.

Η χοριογένεση στα έντομα αποτελεί ένα πρότυπο σύστημα μελέτης της ιστοειδικής και διαφορικής έκφρασης αναπτυξιακά ρυθμιζόμενων γονιδίων, καθώς και των μηχανισμών που εμπλέκονται στην εξέλιξή τους. Στο μεταξοσκώληκα Bombyx moriτα γονίδια του χορίου εκφράζονται ειδικά στα επιθηλιακά κύτταρα των ωοθυλακίων με βάση ένα αυστηρά καθορισμένο αναπτυξιακό πρόγραμμα. Ανάλογα με το αναπτυξιακό στάδιο της χοριογένεσης στο οποίο εκφράζονται, τα γονίδια του χορίου χαρακτηρίζονται ως πρώιμα, ενδιάμεσα και όψιμα. Βάση δομικών χαρακτηριστικών διακρίνουμε δύο τύπους γονιδίων, α και β, καθένας από τους οποίους περιλαμβάνει επιμέρους οικογένειες και υποοικογένειες γονιδίων με διαφορετική αναπτυξιακή εξειδίκευση. Τυπικά, α και β τύπου γονίδια ίδιας αναπτυξιακής εξειδίκευσης είναι οργανωμένα σε ζεύγη με αποκλίνουσα κατεύθυνση μεταγραφής και κοινή ρυθμιστική περιοχή. Επιπλέον, όλα τα γονίδια του χορίου βρίσκονται σε δύο κοντινές περιοχές του χρωμοσώματος 2: η μια (Ch3) περιέχει κυρίως τα πρώιμα γονίδια, ενώ η δεύτερη (Ch1-2) περιέχει τα ενδιάμεσα και όψιμα ζεύγη γονιδίων. Αντικείμενο της διδακτορικής διατριβής αποτελεί η δομική και λειτουργική ανάλυση των 6F6 πρώιμων γονιδίων του χορίου, τα οποία παρουσιάζουν τα εξής ων και όχι μαζί με τα υπόλοιπα πρώιμα γονίδια. Οι ιδιαιτερότητες αυτές έχουν ενδιαφέρον τόσο από εξελικτικής σκοπιάς όσο και από πλευράς ρύθμισης της έκφρασης των πρώιμων γονιδίων.(α) Δομική ανάλυση Πραγματοποιήθηκε προσδιορισμός της πλήρους πρωτοδιάταξης των χρωμοσωμικών κλώνων Β9-Ε4 και Β17-Ε2.4, που περιέχουν τα γονίδια 6F6.2 και6F6.3, αντίστοιχα (το 6F6.1 ήταν ήδη γνωστό από προηγούμενες μελέτες των Λεκανίδου και Ροδάκη) και ακολούθησε ταυτοποίηση των γονιδίων και των επιμέρους περιοχών τους. Με συγκριτική δομική ανάλυση διαπιστώθηκε ότι: τα τρία 6F6 γονίδια έχουν όλα τα χαρακτηριστικά μεταγραφικά ενεργών γονιδίων του χορίου, κωδικοποιούν β-τύπου πρώιμες πρωτεΐνες και παρουσιάζουν πολύ υψηλά ποσοστά ταυτότητας ανάμεσά τους. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός ότι συγκρινόμενα ανά δύο και ανά επιμέρους περιοχές (δηλαδή 5' και 3' γειτονικές περιοχές, μικρό και μεγάλο εξώνιο και εσώνιο), κανένα ζευγάρι 6F6 γονιδίων δεν έχει μέγιστο ποσοστό ταυτότητας σε όλη την έκταση της αλληλουχίας. Η εικόνα αυτή αποτελεί ένδειξη ότι μεταξύ των τριών 6F6γονιδίων συμβαίνουν συχνά γεγονότα γονιδιακής σύγκλισης (gene conversion), τα οποία είναι συνηθισμένα μεταξύ των ενδιάμεσων και όψιμων γονιδίων, όχι όμως και μεταξύ των υπολοίπων πρώιμων β-τύπου γονιδίων. Παρόλο που τέτοια γεγονότα επισκιάζουν τις εξελικτικές σχέσεις μεταξύ των γονιδίων, με βάση την παρούσα δομική ανάλυση των τριών 6F6 γονιδιακών αντιγράφων και των γειτονικών περιοχών τους, προτάθηκε ένα εξελικτικό σχήμα που εξηγεί (α) γιατί τα γονίδια αυτά είναι αζευγάρωτα και (β) πώς διασκορπίστηκαν στην περιοχή των όψιμων γονιδίων.Ο προσδιορισμός της πρωτοδιάταξης των γονιδίων 6F6.2 και 6F6.3 αποκάλυψε,επίσης, την ύπαρξη δύο νέων ανενεργών μεταθετών στοιχείων (IR και ΗΟΡΕ αντίστοιχα), τα οποία παρεμβάλλονται στα εσώνιά τους. Το στοιχείο IR αποτελείται από μια αλληλουχία μήκους 248 bp που περιβάλλεται από δυο ανεστραμμένες επαναλήψεις μήκους 100 bp, ενώ το στοιχείο HOPE έχει χαρακτηριστικά ρετρομεταθετού στοιχείου και φαίνεται να έχει εισβάλλει μέσα σε ένα Bm1 μεταθετό στοιχείο. Ο αριθμός αντιγράφων τους στο απλοειδές γονιδίωμα του B. mori υπολογίστηκε περίπου σε 5 Χ103 για το ΙR και 2 Χ 104 για το ΗΟΡΕ. (β) Λειτουργική ανάλυση Η υποθετική περιοχή των 6F6 υποκινητών εκτείνεται σε απόσταση περίπου 160bp από το σημείο έναρξης της μεταγραφής. Σύγκριση με τους υποκινητές των υπόλοιπων γονιδίων του χορίου έδειξε ότι οι 6F6 υποκινητές δεν έχουν καμία ομοιότητα με τις αντίστοιχες περιοχές των υπόλοιπων πρώιμων γονιδίων, ενώ παρουσιάζουν σημαντικές ομοιότητες με τους υποκινητές των ενδιάμεσων και των όψιμων ζευγών γονιδίων. Δεδομένου ότι οι ομοιότητες αυτές μπορούν να αποδοθούν στα γεγονότα γονιδιακής σύγκλισης που συμβαίνουν συχνά στην περιοχή των όψιμων γονιδίων, έγινε προσπάθεια εντοπισμού ειδικών cis ρυθμιστικών στοιχείων που να είναι υπεύθυνα για τη διατήρηση της έκφρασης των 6F6 γονιδίων στα πρώιμα στάδια της χοριογένεσης.Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκε η 5' γειτονική περιοχή του 6F6.2 υποκινητή(-138 ως +1), η οποία σε ex vivo πειράματα με τη μέθοδο του γονιδιακού βομβαρδισμού ωοθυλακίων, αποδείχθηκε ικανή να κατευθύνει την έκφραση ενός γονιδίου αναφοράς στο σωστό αναπτυξιακό στάδιο και ιστό. Στη θέση -43 ως -56(περιοχή Β) του πιο πάνω υποκινητή προσδιορίστηκε in vitro η αλληλουχία 5'-TAGTTGTTTGGCAAC-3', η οποία αλληλεπιδρά με κάποιον πρωτεϊνικό παράγοντα των θυλακοκυττάρων στα πρώιμα στάδια της χοριογένεσης. Ο παράγοντας αυτός ονομάστηκε pΧ2 και το μοριακό του βάρος υπολογίστηκε περίπου 70 ΚD. Βρέθηκε ότι ο pX2, στα πρώιμα στάδια, αλληλεπιδρά και με τους όψιμους υποκινητές,αναγνωρίζοντας τη θέση πρόσδεσης του παράγοντα ΒCFII, ο οποίος θεωρείται ειδικός για τα όψιμα στάδια. Με βάση το δεδομένο ότι η περιοχή Β και η περιοχή πρόσδεσης του παράγοντα ΒCFII μοιάζουν πάρα πολύ και ανταγωνίζονται πλήρως η μία την άλλη σε πειράματα ΜΚΣ, είναι πιθανό ο παράγοντας pX2 να ταυτίζεται με τον BCFII. Από την άλλη μεριά, βιβλιογραφικά δεδομένα σχετικά με τον υποθετικό παράγοντα BCFII του δίνουν διαφορετικές ιδιότητες από τον pX2. Η περίπτωση να πρόκειται για έναν παράγοντα ο οποίος έχει διαφορετικές ισομορφές ή υφίσταται μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις κατά τη διάρκεια της χοριογένεσης, δεν μπορεί να αποκλειστεί. Επιχειρήθηκε απομόνωση του pX2 από μια χοριογενετική cDNA βιβλιοθήκη έκφρασης, προκειμένου ο παράγοντας αυτός να χαρακτηριστεί και να μελετηθεί ο τρόπος δράσης του. Η προσπάθεια αυτή δεν οδήγησε σε θετικό αποτέλεσμα.Υπάρχουν ενδείξεις ότι στα πρώιμα στάδια, ο pX2 αλληλεπιδρά και με τα υπόλοιπα 6F6 γονίδια, καθώς και με τους υποκινητές γονιδίων του χορίου από διαφορετικά αναπτυξιακά στάδια (πρώιμα ή ενδιάμεσα). Ενδιαφέρον είναι το γεγονός ότι παραλλαγές της θέσης πρόσδεσης του pX2 εντοπίζονται τουλάχιστον μια φορά σε όλους σχεδόν τους υποκινητές του χορίου. Τα παραπάνω υποδηλώνουν ότι ο παράγοντας αυτός μπορεί να έχει μια γενικευμένη δράση κατά τη διάρκεια της χοριογένεσης και η ειδικότητα στην έκφραση των γονιδίων να καθορίζεται από τις αλληλεπιδράσεις του με άλλους παράγοντες, γενικούς ή ειδικούς.